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新冠病毒各种检测方法优缺点对比

 一

核酸检测

 

  • 检测原理:

 
所有生物除朊病毒外都含有核酸,核酸包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。新型冠状病毒(2019-ncov)属于beta冠状病毒属(betacoronavirus),该病毒是蛋白包裹的单链正链rna病毒,寄生和感染高等动物(包括人)。病毒中特异性rna序列是区分该病毒与其它病原体的标志物,新型冠状病毒出现后,我国科学家已经成功发现了新型冠状病毒中的特异性核酸序列。如疑似患者样本中能检测到新型冠状病毒的特异性核酸序列,则认为该患者可能被新型冠状病毒感染。
 
新型冠状病毒常用的核酸诊断方法有两种:病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序。最常见的检测新型冠状病毒特异性核酸序列的方法是荧光定量pcr(聚合酶链式反应)。由于新型冠状病毒是rna病毒,试剂盒检测基本都采用反转录加实时聚合酶链式反应法(rt-pcr),扩增病原体的核酸 (rna) ,同时通过荧光探针实时检测扩增产物。在pcr反应体系中,包含一对特异性引物以及一个taqman探针,该探针为一段特异性寡核苷酸序列,两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;如反应体系存在靶序列,pcr反应时探针与模板结合,dna聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解,报告基团与淬灭基团分离,发出荧光。每扩增一条dna链,就有一个荧光分子产生。荧光定量pcr仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(ct值)与病毒核酸浓度有关,病毒核酸浓度越高,ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。

 

由于每个rt-pcr反应需要2个小时左右才出结果,因此,试剂盒在开发时一般都针对病毒序列中高度保守的2-3个序列比如编码replicase(复制酶)或者necleocapsid(核蛋白衣,核鞘)的核酸序列设计引物,但是各个方法用的序列都不完全相同。一些方法使用multiplex,也就是把多个目标序列在同一反应管中扩增;另一些采用分步,先用一个目标序列筛查,阳性后再用另一个序列确认,这样可以有效缩短整个流程时间,加快检测速度。另外rna病毒变异很快,用多个保守目标序列可以防止病毒变异造成的假阴性。
 

目前批准产品均基于新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(open reading frame 1ab,orf1ab)、包膜蛋白(envelope protein,e)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,n)进行选择。不同产品的检测原理基本一致,但是其引物、探针设计存在不同,有单靶区段(orf1ab)、双靶区段(orf1ab、n蛋白)、三靶区段(orf1ab、n蛋白和e蛋白)的检测和判读差别。一般检测位于病毒orf1ab和n基因上的两个靶标,同一份标本需满足双靶标阳性或重复检测为单靶标阳性或两种标本同时满足单靶标才能确认sars-cov-2病毒核酸阳性。

 

  • 检测流程:

检测程序需要经过五个步骤,取样、留样、保存、核酸提取、上机检测。首先根据试剂盒说明书进行样本采集,样本类型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于rna易降解,因此,采集样本时使用无rna酶的拭子和无rna酶的储存管。获得患者样本后,需尽快进行检测,如无法立即检测需要进行低温封装,并送到专门的检测机构进行检测。检测机构收到样本后,对样本进行核酸提取,核酸提取试剂应使用批准产品说明书中指定的核酸提取试剂盒。最后是荧光pcr核酸检测,也就是上机器检测,将提取物进行荧光pcr扩增反应,需要70—80分钟。

 

 

抗体检测

 

病毒侵入人体后,人体会产生相应的特异性抗体进行防御。免疫球蛋白是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的一类能与抗原特异性结合的血清活性成分,根据分子结构和抗原特异性的不同,将免疫球蛋白分为五类:igg、iga、igm、igd、ige。

 

抗原初次进入机体后,经过一定的潜伏期产生浆细胞并合成分泌抗体。最早出现的是igm,但该抗体维持时间短、浓度低、亲和力较低,在血中持续数日至数周,是急性期感染的诊断指标;在igm接近消失时,igg的含量达到高峰,igg产生晚,但浓度高、维持时间长、亲和力高,血清igg阳性提示感染中后期或既往感染,当数月乃至数年再次接触相同抗原时,最初原抗体量稍有下降,可能是由于一部分原有抗体被再次进入的抗原所结合,从而暂时降低了抗体含量,但短期内抗体含量迅速增加,可能比原来抗体含量高数倍至数十倍,以igg为主,在体内持续时间也长,igm很少增加。
 
本次疫情中,通过研究者对covid-19患者进行研究发现,病毒侵入人体后,igm抗体大约需要5-7天产生,igg抗体在10-15天时产生。2020年3月4日,国家卫生健康委员会发布了最新版本的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》在原有诊疗方案的基础上增加了血清学检测,作为确诊病例和疑似病例的诊断依据之一。血清学检测便是通过检测血液样本中的特异性抗体igm和igg的存在及含量,来间接判断体内有无病毒及病毒感染情况。目前临床中常用的抗体血清学检测方法有3种:酶联免疫吸附试验法、化学发光免疫分析法、胶体金免疫层析法。

 

  • 酶联免疫吸附法(elisa)

elisa是一种结合抗原、抗体特异性反应和酶对底物高效催化作用的高敏感性免疫学实验技术。测定时,受检的标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应结合在固相载体上。固相上的酶量与标本中的受检物质的量成比例。加入酶反应底物后,底物被催化成有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关。所以,可根据呈色的深浅进行半定量或定性分析。该检测方法灵敏度较高,载体标准化难度较低,但检测速度慢、易污染、步骤较为繁琐。在实际应用中,需要根据抗原抗体的特性设计不同的检测法,目前有双抗体夹心法、免疫抑制法、竞争法、直接法&间接法等类型。

 

  • 胶体金免疫层析法

是以胶体金为示踪标志物,应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术,氯金酸(haucl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金试纸,是将胶体金标记的生物大分子在pvc材质的试纸固定,留加样孔,并设检测线和质量控制线。在加样孔上加入样品后,再滴加液体介质,试纸上进行层析。根据试纸上的免疫反应发生结果,即胶体金位置是否有红色条带出现判断检测结果。

 
该方法无需特殊处理标本,仅需一滴血即可在15 min内通过肉眼观察获取检测结果,突破了现有检测技术对人员、场所的限制,缩短检测时间,操作方便快速,在基层医疗单位及现场检测中广泛使用。目前针对新型冠状病毒,已经报道的有两种胶体金试纸,一种是检测新型冠状病毒的抗原-双抗体夹心法,另一种是检测患者血液里特异性针对新型冠状病毒的igm抗体-igm捕捉法。在疫情爆发期,需要大规模做阳性检测时,适合使用总抗检测,同时联卡操作也比较简单,只需要操作一次,而分开检测需要滴加两次样,用两次卡。
 
  • 化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析法是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、抗体、激素等检测。该法灵敏度高于 elisa,具有特异性强、线性范围宽、结果稳定、操作简化等特点,广泛应用于临床标本的检测。但是该方法对设备、操作、使用环境的要求比较高,使用时需要配套的化学发光仪器。

 

抗体检测的灵敏度和特异度:灵敏度反映诊断试验检出感染者的能力,若过低,会出现较多假阴性结果,影响疾病的诊断、干预和预后,严重可导致患者过早死亡;特异度衡量诊断试验正确判断非感染者的能力,若过低,则会出现较多假阳性结果,导致医疗资源的浪费,并造成患者及群众的焦虑和恐慌。因此,具有较高灵敏度和特异度是抗体检测技术的应用基础。

 

 

不同检测方法优缺点对比

 

与抗体血清学检测相比,核酸检测能够检测到处于窗口期的患者,及早发现感染者,是新型冠状病毒检测的“金标准”,但是对检测设备或平台要求较高,高灵敏度的rt-pcr仪价格昂贵,对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。此外,核酸检测耗时较长,考虑到样本运输、样本积压的情况,通常最快24小时才可以报告结果。

 
与核酸检测相比,抗体血清学检测的血液标本更易获取且标本质量有保证、操作简单快捷、很大程度上降低了医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险、更易于基层实验室展开筛查工作等。如果说核酸检测病毒的核糖核酸(rna),是病毒存在的直接证据,那么抗体检测的就是患者血液中被刺激产生的抗体,是间接证据,对临床有提示作用。当核酸检测阴性时,将igm和igg抗体检测增加进去,可以弥补核酸检测容易造成漏诊的缺点。

目前市场上主流的抗体检测方法学是化学发光,但化学发光平台对设备、操作、使用环境的要求比较高。对比核酸检测,化学发光的核心优势就是取样及操作简易,但没有快速检测的优势。针对于普通筛查或者说针对于非发达国家,胶体金检测方法对人员、场地、设备要求都非常低,适用于大规模的快速检测。国际企业如罗氏、雅培等在胶体金方面是没有技术储备的,实际上全球的胶体金检测(包括新冠肺炎、传染病、流感、疟疾、性病等)大部分的供应量还是在中国。