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蛋白质测定方法和原理

蛋白质测定的原理和方法

一、粮油及其制品中蛋白质的测定

蛋白质的测定方法一般是根据蛋白质的理化特性来确定的,主要分为两类:一类是利用蛋白质共性的方法,例如凯氏法、双缩脲法等;另一类是利用蛋白质中含有特定氨基酸残基的方法,例如酚试剂法、紫外光谱吸收法、色素结合法等。

在粮食品质分析中应用最普遍的是凯氏法。该法是1883年由丹麦化学家凯道尔创立的,适宜于测定任何形态的样品,而且具有很高的准确度和精密度,一直被作为蛋白质定量的标准方法。近几年来对凯氏法进行了多方面的改进,目前正向自动检测方面发展。

1、常量凯氏定氮法

1)原理:将含有蛋白质的样品与浓h2so4共热,其中的氮变成铵盐状态后再与浓碱作用,放出的氨用酸吸收,滴定剩余的酸,即可算出含氮量。具体测定步骤可用消化、蒸馏、吸收与滴定来概括。

消化是指将蛋白质与浓h2so4混合加热,蛋白质被分解,其中的碳被氧化成co2,所含的氮则转变成氨,并与h2so4化合形成硫酸铵残留于消化液中。

2nh2(ch2)2cooh+13h2so4 =(nh4)2so4+6co2+12so2+16h2o

由于上述反应进行很慢,消化需要很长时间,加入催化剂可加快反应速度,cuso4是常用的催化剂,k2so4能提高溶液的沸点,常将它们混合使用,起加速氧化、促进有机物分解的作用。k2so4的用量不宜过大,否则温度过高,生成的(nh4)2so4会分解,放出氨,使氮损失。

蒸馏是将消化所得的(nh4)2so4加碱蒸馏,氨又被释放出来。

2naoh+(nh4)2so4 = 2nh3+na2so4+2h2o

需要注意的是加入naoh溶液要过量,而且要防止样液中nh3的逸出。可用cuso4作碱性指示剂,以黑色cuo出现为宜

吸收与滴定是将生成的氨用标准hcl吸收,剩余的未被中和的hcl则用标准naoh溶液滴定。所用hcl的摩尔数减去滴定所消耗的naoh的摩尔数,就是被吸收氨的摩尔数

生成的氨也可直接用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后,指示剂的颜色变化,再用hcl滴定,直至恢复到原来的氢离子浓度为止,用去hcl的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数

2nh3+4h3bo3 = (nh4)2b4o7+5h2o

(nh4)2b4o7+5h2o+2hcl=2nh4cl+4h3bo3

由于各种蛋白质中氮的质量分数通常为16%左右,将氮的质量分数乘以蛋白质系数,即得粗蛋白质的质量分数。

2)仪器:凯氏烧瓶(500ml)、锥形瓶(250ml)、定管(50ml)、移液管(50ml)、量筒(100ml)、定氮蒸馏装置

3)试剂:浓、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂:5份1g/l溴甲酚绿乙醇溶液与1份甲基红乙醇溶液,按5:1体积临用时混合、40g/l硼酸吸收液:称取20g硼酸溶解于500ml热水中,摇匀备用、0.1000mol/l hcl标准溶液

4)操作方法

准确称取固体样品0.2~2g(半固体样品2~5g,液体样品10~20ml),小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中,加入研细的cuso40.5g,k2so410g和浓h2so420ml,轻轻摇匀,安装消化装置,并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热,待内容物全部炭化、泡沫停止产生后,加大火力,使瓶内液体微沸,液体变蓝绿色透明后,再继续加热微沸30min。冷却,小心加入200ml蒸馏水,再放冷,加入玻璃珠数粒以防蒸馏时爆沸。

将凯氏瓶安装好蒸馏装置,塞紧瓶口,冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预先装入50ml40g/l硼酸吸收液及混合指示剂2~3滴)。放松夹子,通过漏斗加入70~80ml400g/lnaoh溶液,并摇动凯氏烧瓶,瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀后,再加入100ml蒸馏水(从漏斗中加入),夹紧夹子,加热蒸馏,至氨全部蒸出(馏液约250ml即可),将冷凝管下端提离液面,用蒸馏水冲洗管口,继续蒸馏1min,用表面皿接几滴馏出液,以奈氏试剂检查,若无红棕色物生成,表示蒸馏完毕,即可停止加热。否则应继续蒸馏。将上述吸收液用0.1000mol/l hcl标准溶液直接滴定至灰色即为终点,记录hcl标准溶液的用量。同时做空白试验(除不加样品外,其他操作完全相同),记录空白试验消耗hcl标准溶液的体积。

5)结果计算

蛋白质质量分数的计算公式为w(蛋白质)=〔m×f×c(v1-v2) ×100〕/(1000×m)=〔f×c(v1-v2) ×1.4〕/ m       式中:      w(蛋白质)——蛋白质的质量分数(%)   m——样品的质量 (g)    m/14——氮的摩尔质量 (g/mol) c——hcl标准溶液的浓度 (mol/l)  v1——滴定样品吸收液时消耗hcl标准溶液的体积 (ml)   v2——滴定空白吸收液时消耗hcl标准溶液的体积 (ml)   f——氮换算为蛋白质的系数

蛋白质中氮的质量分数一般为15~17.6%,按16%计算乘以6.25即为蛋白质的质量分数。蛋白质系数:乳制品为6.38;肉及其制品为6.25;玉米、高粱为6.24;米为5.95;大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83;大豆及其制品为5.71;面粉为5.70;花生为5.46;芝麻、向日葵为5.30

6)注意事项

蒸馏装置不能漏气;蒸馏前若加碱量不足,消化液呈蓝色,不生成cu(oh)2沉淀,此时需增加naoh的用量;硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则对氨的吸收作用减弱而造成损失,此时可置于冷水浴中使用;蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面清洗管口,再蒸1min后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸;所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配制;消化时不要用强火,应保持和缓沸腾,注意不断转动凯氏烧瓶,以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全;样品中若含脂肪或糖较多时,消化过程中易产生大量泡沫,为防止泡沫逸出瓶外,在开始消化时应用小火加热,并不断摇动;也可以加入少量的辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂,并同时注意控制热源强度;当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却,加入30%(体积分数)h2o22~3ml后再继续加热消化;若取样量较大,如干试样超过5g,可按每克试样5ml的比例增加h2so4用量;一般消化至呈透明后,继续消化30min即可,但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品,如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时,需延长消化时间。有机物若分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色;混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。

2、微量凯氏定氮法

1)原理:同常量凯氏定氮法

2)仪器和用具:凯氏烧瓶(100ml)、万用电炉、微量滴定管(10ml)、移液管(10ml)、容量瓶(100ml)、洗耳球、乳胶管、微量凯氏定氮蒸馏装置

3)试剂:0.01000 mol/l hcl标准溶液:其他试剂同常量凯氏定氮法

4)操作方法:样品消化步骤同常量凯氏定氮法

将消化完全的溶液冷却后,全部移入100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。装好微量定氮装置。量取消化稀释液10ml置于反应管内,经漏斗再加入10ml400g/lnaoh溶液使其呈强碱性,用少量蒸馏水冲洗漏斗数次,夹好漏斗夹,进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10ml40g/l(或20 g/l)硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时,继续蒸馏10min后,将冷凝管下端提离液面再蒸馏1min,用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液用0.01000 mol/l hcl标准溶液滴定至灰色为终点。同时做空白试验。

5)结果计算

样品中蛋白质质量分数的计算公式为

w(蛋白质)={〔f×c(v1-v2) ×14 ×100〕/1000}/〔(10×m)/100〕

=f×c(v1-v2) ×14/m          式中:      w(蛋白质)——样品中蛋白质的质量分数(%)  m——样品的质量或体积 (g)    14/ m——氮的摩尔质量 (g/mol)    c——hcl或 h2so4标准溶液的物质的量的浓度 (mol/l)      v1——样品消耗hcl或 h2so4标准溶液的体积 (ml)     v2——试剂空白消耗hcl或 h2so4标准溶液的体积 (ml)      f——氮换算为蛋白质的系数

6)说明

         20 g/l硼酸吸收液每次用量25ml,用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2滴;在蒸馏时,蒸汽发生要均匀充足,蒸馏过程中不得停火断气,否则将发生倒吸;加碱要足量,操作要迅速;漏斗应采用水封措施,以免氨由此逸出损失;双试验结果允许误差:粗蛋白质的质量分数在15%以下时,不超过0.2%;蒸馏前将水蒸气发生器内装水至2/3体积处,加甲基橙指示剂数滴及h2so4数毫升以使其始终保持酸性,可避免水中的氨被蒸出而影响测定结果;粗蛋白质的质量分数在15%以上时,误差不超过0.4%。求其平均数,即为测定结果,测定结果取小数点后一位。

二、饮料中蛋白质的测定

1、原理:同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。

2、仪器:同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。

3、试剂:同“粮油及其制品中蛋白质的测定”中的常量凯氏定氮法。

4、测定方法:准确吸取饮料样品10~20ml,移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中,加入研细的cuso40.5g、k2so410g和浓h2so420ml,轻轻摇匀,安装消化装置,并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热,待内容物全部炭化、泡沫停止产生后,加大火力,保持瓶内液体微沸,液体变蓝绿色透明后,再继续加热微沸30min。冷却,加入200ml蒸馏水,再放冷,加入玻璃珠数粒以防蒸馏时爆沸。