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微生物大肠杆菌检验

一、调味品、酱腌制品中大肠菌群的测定

测定方法见“糕点、糖果中大肠菌群的测定”

二、月饼中大肠菌群的测定(实训)

1、仪器及试剂

1)仪器:恒温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、直径为90mm的平皿、试管、广口瓶或三角瓶、吸量管、载玻片、接种针、直径为5mm的玻璃珠、酒精灯、试管架

2)试剂:单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂(emb)、ec肉汤、磷酸盐缓冲溶液、生理盐水、革兰氏染色液

2、操作步骤

以无菌操作将25g月饼放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌三角烧瓶内或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨制成1:10均匀稀释液。用1ml灭菌吸量管吸取1:10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管使其混匀,制成1:100稀释液。另取1ml灭菌吸量管,按上述操作顺序做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1ml灭菌吸量管。根据月饼污染情况的估计,选择3个稀释度,每个稀释度接种3管。选择3个稀释度分别接种于乳糖发酵管内,接种量在1ml以上者,可用双料乳糖胆盐发酵管;1ml或1ml以下者,可用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置于(36±1)℃恒温箱内,培养(24±2)h,若所有乳糖发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性;若有产气者,则按下列程序进行检验;将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置于35~37℃恒温箱内,培养18~24h,然后取出观察菌落形态,并做革兰氏染色、镜检和乳糖复发酵试验。在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置于(36±1)℃恒温箱内,培养(24±2)h,观察产气情况。

3、数据记录及处理

1)将各步试验结果填入下表中

符号 接种量/ml 乳糖胆盐发酵管发酵情况 emb平板上菌落的生长情况 革兰氏染色及镜检情况 复发酵管发酵情况 结论
             
             
             

2)根据上述结果查mpn检索表,得出被检样品每100g中大肠菌群细菌的最可能数。

三、糕点、糖果中大肠菌群的测定

1、原理:大肠菌群是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌注意来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,具有广泛的卫生学意义。

食品中大肠菌群数是以每100ml(g)检样内大肠菌群的最可能数(the most probable number,简称mpn)表示。据此含义,所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以100ml(g)食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数,一方面能表明食品中有无粪便污染,另一方面还可以根据数量的多少,判定食品受污染的程度。

2、培养基及试剂:乳糖发酵管,伊红美蓝琼脂(emb),生理盐水,革兰氏染色液,单料乳糖胆盐发酵管,双料乳糖胆盐发酵管。

3、器具及其他用品:恒温箱、广口瓶或三角瓶、吸量管、载玻片、水浴锅、天平、显微镜、玻璃珠:直径为5mm、酒精灯、均质器或乳钵、温度计、平皿:直径为90mm、试管、接种针、试管架

4、

5、检样稀释

1)以无菌操作将检样25ml(g)放入含有225ml灭菌生理盐水的灭菌三角瓶内或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨制成1:10均匀稀释液。

2)用1ml灭菌吸量管吸取1:10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管使其混匀,制成1:100稀释液。

3)另取1ml灭菌吸量管,按上述操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1ml灭菌吸量管。

4)根据糕点及糖果卫生标准的要求或对检样污染情况的估计,选择3个稀释度,每个稀释度接种3管。

6、发酵试验

选择3个稀释度分别接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1ml以上者,可用双料乳糖胆盐发酵管;1ml及1ml以下者,可用单料乳糖胆盐发酵管。每个稀释度接种3管,置于(36±1)℃恒温箱内,培养(24±2)h,若所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性;若有产气者,则按下列程序进行检验。

7、分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置于35~37℃恒温箱内,培养18~24h,然后取出观察菌落形态,并做革兰氏染色、镜检和乳糖复发酵试验。

8、复发酵证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置于(36±1)℃恒温箱内培养(24±2)h,观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

9、报告

根据实验证实为大肠菌群阳性的管数,查表可知。报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。

10、注意事项

挑取菌落:大肠菌群是一群肠道杆菌的总称,大肠菌群菌落的色泽、形态等复杂多样,而且与大肠菌群的检出率密切相关。在实际工作当中,为了提高大肠菌群的检出率,应当熟悉其菌落的形态和色泽。在检验方法中我们选用伊红美蓝平板为分离培养基,在该平板上,大肠菌群菌落大多呈紫黑色有金属光泽或无金属光泽。菌落形态的其他方面(如菌落的大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、隆起情况、湿润与干燥等)虽也应注意,但不如色泽方法更为重要。挑取菌落数与大肠菌群的检出率也有密切的关系。在实际工作中由于工作量大,通常只挑取一个菌落,但影响大肠菌群检出率的因素很多,如食品种类、菌落色泽和形态、细菌种类等,只挑取一个菌落,由于几率问题,很难避免假阴性的出现,尤其当菌落不典型时。所以,挑取菌落时一定要挑取典型菌落,若无典型菌落则应多挑取几个菌落,以免出现假阴性。

程序:大肠菌群的国标检验法采用三步法,即乳糖发酵、分离培养和证实试验。第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果,不是纯菌的发酵试验,所以初发酵阳性管,经过后两步,有可能成为阴性。大量检验数据证明,食品中大肠菌群检验程序的符合率、初发酵与证实试验相差很大,不同食品三步法俄符合情况也不一致。一般来说,如果平板上有较多典型大肠菌群菌落,革兰氏染色为阴性杆菌,即可做出判定。如果平板上典型菌落较少或均不够典型,则应多挑菌落做证实试验,以免出现假阴性。只做一步初发酵,对某些食品来说误差较大。这样做,会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理,应予以注意。

产气量:在糖发酵试验中经常可以看到,在发酵套管内存在极微小的气泡(有时比小米粒还要小),类似这种情况能否算作产气阳性,这是许多人经常遇到的问题。大肠菌群的产气量,多者可以使发酵套管充满气体,少者产生比米粒还小的气泡。一般来说,产气量与大肠菌群检出率呈正比的关系,但随样品种类而有不同,有米粒大小的气泡的也有阳性检出,另外,对未产气的乳糖发酵管是否均应做阴性处理,根据大量实践工作经验来看,对这种情况应慎重考虑,有时会遇到在初发酵时产酸无气,但复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时套管内虽无气体,但在液面及管壁可以看到缓缓上升的小气泡。所以对未产气的发酵管有疑问时,可用手轻轻敲动或摇动试管,若有气泡沿管壁上浮,即考虑为有气体产生,应做进一步试验观察。这种情况的阳性检出率可达半数以上。

mpn检索表:mpn表示样品中活菌密度的估测。mpn检索表是采用3个稀释度9管法,稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测,较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性,而最高稀释度3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数,则应做一定范围的稀释度。

在查阅mpn检索表时,应注意以下问题:在mpn检索表第一栏阳性管数下面列出的ml(g)是指原样品(包括液体和固体)的量,并非稀释后的量。对固体样品更应注意:如固体样品1g经10倍稀释后,虽加入1ml量,但实际其中只含有0.1g样品,故应按0.1g计算。mpn检索表中只提供三个稀释度,即1ml(g)、0.1 ml(g)、0.01ml(g);若改用10ml(g)、1 ml(g)、0.1ml(g)时,则表内数字应相应降低或增加10倍。其余可类推。