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微生物检验无菌操作

一、常用的灭菌方法

1、过滤除菌法

凡不能耐受高温或化学药物灭菌的药液、毒素、血液等。可使用过滤除菌法除菌。

2、紫外线杀菌法

日光中杀菌的主要成分是紫外线。紫外线波长200~300nm,具有杀菌作用,其中以253.7nm最强,这与dna的吸收光谱范围一致。紫外线的穿透力不强,普通玻璃、尘埃、水蒸气均能阻挡紫外线,故只能用于手术室、无菌室等空气消毒,也可用于不耐热物品或包装材料的表面消毒。在消毒照射时,工作人员应佩戴保护眼睛,以防紫外线损害角膜而引起急性角膜炎。

3、加热灭菌

加热灭菌是通过加热高温使菌体内蛋白质变性凝固,酶失活,从而达到杀菌的目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低。

加热灭菌法包括湿热灭菌和干热灭菌两种。在同一温度下,湿热的灭菌效力比干热大,湿热的穿透力比干热强,可增加灭菌的效力;湿热的蒸汽有潜热存在,这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度。

1)湿热灭菌法:常用的湿热灭菌法有巴氏消毒法、煮沸消毒法、流通蒸汽消毒法及高压蒸汽灭菌法。

①巴氏消毒法:某些物质在高温下易被破坏、巴斯德首先提倡把液体物质在较低的温度下进行消毒,这样即可杀死液体中致病菌的繁殖体,又不破坏液体物质中原有的营养成分。牛奶或酒类常用此法消毒。典型的温度时间的组合有两种:一种是61.1~62.8℃,30min;另一种是72℃,15~30min,现多用后一种。

②煮沸消毒法:此方法适用于器材、器皿、衣物及小型日用物品的消毒。

③间歇灭菌法:此方法适用于不宜高温灭菌的物质,如不耐热的药品、含血清的培养基等。

为了消灭其中的芽孢,须用间歇灭菌法。方法是用阿诺氏灭菌器、水浴锅或蒸笼加热约100℃持续30min,每日进行一次,连续两天。为了达到彻底灭菌,照上法再进行第三次加热,这样所有的芽孢将被全部杀死。必要时,加热温度可低于100℃(如75~95℃),而延长每次加热的时间至30~60min,或增加加热次数,也可收到同样的效果。

④高压蒸汽灭菌法:高压蒸汽灭菌是微生物试验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是利用水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理。当蒸汽压力达到103.4kpa时,水蒸气的温度升高到121℃,经15~20min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。此法适用于耐高温而又不怕蒸汽的物品的灭菌,一般培养基和敷料、生理盐水、耐热药品、金属器材、玻璃仪器以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。

2)干热灭菌法:通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌法。一般是把待灭菌的物品包装好后,放入干燥箱中加热至160℃,维持2h。常用于空玻璃仪器、金属器具的灭菌。凡带有橡胶的物品、液体及固体培养基等都不能用此法进行灭菌。

①灭菌前的准备:玻璃仪器等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃仪器灭菌后不被外界杂菌所污染。

常用玻璃仪器包装和加塞的方法:平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内,三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外界杂菌所污染;吸管用拉直的曲别针将棉花轻轻的捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花可统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸条捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌。

②干燥箱灭菌:将包扎好的物品放入干燥箱内,注意不要摆放太密,以免妨碍空气流通;不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160℃并恒温2h,注意勿使温度过高,若超过170℃,器皿外包裹的纸张、棉花会被烧焦燃烧。如果是为了烘干玻璃仪器,温度为120℃持续30min即可。温度降至50~60℃时方可打开箱门,取出物品,否则玻璃仪器会因骤冷而爆裂。

另外,被污染的纸张、试验用动物尸体等无经济价值的物品可以通过火焚烧掉;对于接种环、接种针或其他金属用具等耐燃物品,可用火焰灼烧灭菌法直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌;直接用火焰灼烧灭菌,迅速彻底。此外,在接种的过程中,试管或三角瓶口,也采用灼烧灭菌法通过火焰灼烧而达到灭菌的目的。

二、消毒与灭菌

1、防腐

防止或抑制微生物生长繁殖的方法称为防腐。用于防腐的药物称为防腐剂。某些药物在低浓度时是防腐剂,在高浓度时则为消毒剂。

2、无菌及无菌操作

无菌是指物体中没有活的微生物存在。防止微生物进入人体或物体的操作方法,称为无菌技术或无菌操作。食品微生物的检验操作,必须在无菌环境中用无菌操作进行。

3、灭菌

杀灭物体中或物体上所有微生物(包括病原微生物和非病原微生物)的繁殖体和芽孢的过程称为灭菌。灭菌的方法有物理灭菌法和化学灭菌法两种。

4、消毒

用物理、化学或生物学的方法杀死病原微生物的过程称为消毒。具有消毒作用的药物称为消毒剂。一般消毒剂在常用浓度下,只对细菌的繁殖体有效,对于细菌芽孢则无杀灭作用。

 

 

三、影响灭菌与消毒的因素

1、微生物的特性

不同的微生物对热的抵抗力和对消毒剂的敏感性不同,细菌、酵母菌的营养体、霉菌的菌丝体对热较敏感,放线菌、酵母、霉菌的孢子比营养细胞抗热性强。

不同菌龄的细胞,其抗热性、抗毒力也不同,在同一温度下,对数生长期的菌体细胞抗热力、抗毒力较小,稳定期的老龄细胞抗性较大。

2、温度

温度越高,灭菌效果越好。菌液被冰冻时,灭菌效果则显著降低。

3、湿度

熏蒸消毒,喷洒干粉,喷雾都与空气的相对湿度有关。相对湿度合适时,灭菌效果最好。此外,在干燥的环境中,微生物常被介质包裹而受到保护,使电离辐射的作用受到限制,这时必须加强灭菌所需的电离辐射剂量。

4、灭菌处理剂量

灭菌处理剂量是指处理强度和处理方法对微生物的作用时间。所谓强度,在加热灭菌中指灭菌的温度;在辐射灭菌中指辐射的剂量;在化学药剂消毒中指的是药物的浓度,一般来说,强度越高,作用时间越长,对微生物的影响越大,灭菌程度越彻底。

5、酸碱度

大多数的微生物在酸性或碱性溶液中,比在中性溶液中容易被杀死。

6、氧

氧的存在能加强电离辐射的杀菌作用。当有氧存在时,h可与氧产生有强氧化作用的h2o和h2o2,与无氧照射时相比,杀菌作用要强2.5~4倍。

7、介质

微生物所依附的介质对灭菌效果的影响较大。介质成分越复杂,灭菌所需的强度越大。

8、微生物污染程度

待灭菌的物品中含菌数较多时,灭菌越是困难,灭菌所需要的时间和强度均应增加。这是因为微生物群集在一起,加强了机械保护作用,而且抗性强的个体增多,也增加了灭菌的难度。

9、穿透条件

杀菌因子只有同微生物细胞相接触,才可以发挥作用。在灭菌时,必须创造穿透条件,保证杀菌因子的穿透,灭菌时所需时间应比液体培养基长;湿热蒸汽的穿透能力比干热蒸汽强;环氧己烷的穿透能力比甲醛强。

四、常用的消毒方法

实验室中常用的消毒灭菌化学试剂见下表:

实验室中常用的消毒灭菌化学试剂

类别

试剂

常用浓度

用途

烷化剂

福尔马林(甲醛)

370~400g/l

熏蒸空气(接种室、培养室)

2~6ml/m3

去污剂

新洁尔灭肥皂

1g/l

皮肤及器皿消毒;浸泡用过的玻片、盖片;皮肤清洁剂

碱类

烧碱(naoh)

40g/l

病毒性传染病

石灰水(ca(oh)2

10~30g/l

粪便消毒,畜舍消毒

酸类

无机酸(如hcl)

2%(质量分数)

玻璃器皿的浸泡

有机酸(如乳酸)

80%(体积分数)

熏蒸空气,1ml/m3

醋酸

20%(质量分数)

熏蒸空气,3~5ml/m3

食醋

20%(质量分数)

熏蒸空气,预防流感

石炭酸

3~5%(质量分数)

室内喷雾消毒,擦洗被污染的桌,地面

酚类

来苏水

3~5%(体积分数)

皮肤消毒,浸泡用过的吸管等玻璃器皿

醇类

乙醇

70~75%(体积分数)

皮肤消毒(对芽孢无效)或器皿表面消毒

氧化剂

kmno4

1~30g/l

皮肤,水果,茶具消毒

漂白粉

10~50g/l

洗刷培养室,饮水消毒(对噬菌体有效)

染料

结晶紫

20~40g/l

体表及伤口消毒

五、微生物的接种和培养

将微生物的纯种或含有微生物的材料(如水、食品、空气、土壤、排泄物等)转移到培养基上的过程叫微生物接种。经微生物接种后的培养基被放置在一定环境条件下,使微生物在培养基上生长繁殖,这一过程叫做微生物的培养。

1、微生物的接种方法

倾注法:取少许纯菌或少许纯菌材料(一般是液体材料),先放入液体的培养皿中,而后倾入已溶化并冷却至46℃左右含有琼脂的灭菌培养基上,使它与含菌材料均匀混合后,冷却使其凝固。

浸洗法:用接种针挑取接种材料后,即插入液体培养基中,将菌洗入培养基内。有时也可将某些固形含菌材料直接浸入培养液中,把附着在表面的菌体洗下。

涂布法:将纯菌或含菌材料(包括固形物或液体)均匀地分布在固体培养基表面,或者将含菌材料在固体培养基的表面仅作局部涂布,然后再用划线法使它分散在整个培养基的表面。

点植法:将纯菌或含菌材料用接种针在固体培养基表面的几个点接触一下。点植法常用于霉菌的接种。

穿刺法:用接种针将微生物纯种经穿刺而进入到培养基中去。穿刺法常应用于半固体深层培养基,通过穿刺进行培养,可以有助于探知这种菌种对氧的需要情况以及有无动力产生。

划线法:将纯菌或含菌材料用微生物接种法在固体培养基表面进行划线,使微生物细胞能分散在培养基的表面,并使接种量在培养基表面起着稀释作用,即在培养基的单位面积内的接种量从多量逐渐依次减少为少量。划线法是进行微生物分离时的一种常规接种法。

活体接种:活体接种应用于病毒培养,因为病毒必须接种在生活的组织细胞中才能生长繁殖。如果要分离某些病原微生物或检查某些病原微生物的致病特性以及毒力测定时,一般用活的动物进行接种。

2、微生物的培养

人工培养微生物的过程中,除了供给一定的营养物质外,还必须提供微生物生长繁殖的条件,但因不同种类的微生物需要的条件不完全相同,所以就有需氧培养、厌氧培养等不同的方式。

厌氧培养:培养厌氧性微生物时,要除去培养基中的氧或使氧化还原点位降低,并在培养过程中一直保持与外界氧隔绝以使厌氧微生物生长。在培养中保持无氧环境的方法有物理法除氧、化学法除氧和生物法除氧。

需氧培养:对需氧微生物的培养必须在有氧的环境中进行,在实验中,液体或固体培养基经接种微生物后,一般将其置于保温箱中在有氧的条件下培养。有时为了加速繁殖的速度或进行大量的液体培养时,可用通气搅拌或振荡的方法来充分供氧,但通入的空气必须经过净化或无菌处理。