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鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测 bjs 201907

鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测
bjs 201907
1 范围
本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼(anoplopoma fimbria)、油鱼(lepidocybium flavobrunneumruvettus pretiosus)和南极犬牙鱼(dissostichus eleginoidesdissostichus mawsoni)源性成分的实时荧光pcr检测方法。
本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品(不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品)中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。
2 原理
使用商业化dna提取试剂盒,获得适用于实时荧光pcr检测的dna。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针,通过实时荧光pcr反应,获得ct值,根据ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。
3 试剂和材料
除另有规定外,本方法中所用试剂均为分析纯,水应符合gb/t 6682的一级水要求。所有试剂均用无dna酶污染的容器分装。
3.1引物探针序列
3.1.1裸盖鱼源性成分nadh2基因
裸盖鱼源成分5 ’端引物:5 ’-agggaccaccctaacattcg-3 ’
裸盖鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-gtgggtggtgatgctgtgct-3 ’
裸盖鱼源性成分探针:5 ’-fam-cagctctcactgactactcgcatga-bhq1-3 ’
3.1.2油鱼源性成分cytb基因
油鱼源性成分5 ’端引物:5 ’-taacttcggatgactcatccg-3 ’
油鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-agtaaaggcctcgtccaatgt-3 ’ 
油鱼源性成分探针:5 ’-fam-catccgaaaccttcatgcaaacggc-bhq1-3 ’
3.1.3 南极犬牙鱼源性成分ck基因
南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物:5 ’-ctgaatatgtaggtgcatacg-3 ’
南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-ttgctctttgtgtttcggtt-3 ’
南极犬牙鱼源性成分探针:5 ’-fam-tccattaggtaagcgagcgggaaga-bhq1-3 ’
3.1.4内参照基因真核生物18srrna
内参照5 ’端引物:5 ’-tctgccctatcaactttcgatggta-3 ’
内参照3 ’端引物:5 ’-aatttgcgcgcctgctgccttcctt-3 ’
内参照探针:5 ’-fam-ccgtttctcaggctccctctccggaatcgaac-bhq1-3 ’
3.2 商业化dna提取试剂盒。
3.3 商业化pcr反应预混液。
4 仪器和设备
4.1实时荧光pcr仪。
4.2微量紫外分光光度计。
4.3恒温水浴锅。
4.4高速冷冻离心机:离心力18,000 g以上。
4.5微量移液器(0.5 μl- 10 μl,10 μl- 100 μl,20 μl- 200 μl,100 μl- 1000 μl)。
4.6 涡旋振荡器。
4.7 天平:感量0.001 g。
5 分析步骤
5.1 样品前处理
(1)样品只有单块鱼肉组成:使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。
(2)样品有五块以下鱼肉组成:使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。
(3)样品有五块以上鱼肉组成:随机挑选5块鱼肉,使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。
将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤,离心去除上清液,尽可能剪碎并混匀。
注:速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。
5.2 dna提取
按照商业化dna提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品,每个样品设置两个平行,按照商业化dna提取试剂盒说明书操作。
5.3 dna浓度测定
取1 μl dna溶液,使用微量紫外分光光度计按照dsdna(双链dna)计算方式检测其浓度。
5.4 实时荧光pcr扩增
实时荧光pcr反应体系见表1。
 
表1 实时荧光pcr反应体系
pcr预混液(2 ×) 10 μl
10 μmol/l上游引物 0.4 μl
10 μmol/l下游引物 0.4 μl
10 μmol/l 探针 0.2 μl
dna 20-50 ng
灭菌去离子水 补充至总体积20 μl
 
pcr反应程序:95 ℃ 15 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s(读取荧光),40个循环。
5.5 实验对照
分别设置阳性对照、阴性对照、pcr空白对照、空白提取对照各一个。
阳性对照:含相应物种的dna。
阴性对照:不含相应物种的dna。
pcr空白对照:以灭菌去离子水替代dna加入实时荧光pcr反应体系。
空白提取对照:以灭菌去离子水替代样品进行dna提取。
6 结果判断与表述
6.1 质量控制
若以下条件的其中一条不满足要求时,结果视为无效:
阳性对照:荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的ct值<30.0;
阴性对照:ct值≥35.0;
pcr空白对照:ct值≥35.0;
  空白提取对照:ct值≥35.0;
内参照反应:荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的ct值<30.0;
样品平行反应:ct值经6.2结果判定后应一致。
6.2 结果判定
(1)如ct值<30.0,且质量控制符合要求,则判定为检出相应物种源性成分。
(2)如ct值≥30.0,且质量控制符合要求,则判定为未检出相应物种源性成分。
6.3 结果表述
检出 xxx 源性成分。
未检出 xxx 源性成分。
7 防污染措施
检测过程中放置交叉污染的措施按照gb/t 27403中的规定执行。
8 方法检出限
裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1 %~5 %,油鱼引物探针检出限范围为1 %~10 %,南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1 %~2 %。
注:因使用的设备、试剂盒不同,其检出限有所差异。
 
本方法负责起草单位:深圳市计量质量检测研究院。
验证单位:河南省产品质量监督检验院、天津市食品安全检测技术研究院、重庆市食品药品检验检测研究院、福建省食品药品质量检验研究院、广东省食品检验所。
主要起草人:林霖、张世伟、吴佳辉、王坤、杨国武、杨俊。