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微生物取样、样品制备技巧及稀释、接种、培养方法汇总

 一、样品前处理
(1)无论何种抽样方案,均要求样品有代表性。采样过程遵循无菌操作程序,防止一切可能的外来污染。

如果是冷冻样品按要求冷冻保藏,干燥食品可放在常温冷暗处,易腐和冷藏样品应放入10℃环境。冷冻样品来不及检验应放入-15℃以下冰箱内,待检样品存放时间不应超过36h。



(2)样品解冻

如果是冷冻样品,样品取出后,在0-8℃的冰箱中解冻,时间不超过18小时;也可在温度不超过45℃环境中解冻,时间不超过15min。



(3)检测前准备

实验前将工器具移到无菌间,最好用紫外线照射20min分钟灭菌消毒,达到无菌状态。

操作试验的准备物品均质杯、酒精及酒精棉、移液器、灭菌枪头、平皿、稀释液、剪刀、镊子、无菌盆或筐等物品,检查一下是否齐全。



二、检测

1、 样品标识

将样品进行相应标识标记,其中菌落总数按照4789.2操作,每一个稀释度做两个平行,一般做三个稀释度每个样品一摞。



大肠菌群及金黄色葡萄球菌按照4789.3和4789.10中的mpn法检测,每个稀释度3根管,一般也是做3个稀释度。



2 取样

先将样品外包装正反面用酒精喷洒(如果样品表面有冷凝水先擦拭干净后再用酒精喷洒)

(1)固体样品

① 75%酒精棉消毒开启部位及其周围,再用火焰灭菌的剪刀剪开。

② 在电子称上放上均质杯去皮调整至零。

③ 用火焰灭菌后的剪刀和镊子取样,称取25g有代表性样品。

④ 加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水(开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次,以杀灭从空气中落入杂菌)后。

⑤ 擦拭干净剪刀镊子后浸泡于75%酒精容器中。

⑥将均质杯盖上盖子后8000转均质1-2min后作为样液。

(2)液体样品

①冷冻样品完全解冻后使用。

②75%酒精棉消毒开启部位及其周围,再用火焰灭菌的剪刀开启,用灭菌吸管取充分混合后样25ml。

③加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水混匀作为样液。



(3) 粉末状样品以及半固体样品

①将样品混合均匀。

②75%酒精棉消毒开启部位及其周围,再用火焰灭菌的剪刀开启,以无菌匙采取混合后样10g。

③加入90ml灭菌磷酸盐缓冲液,开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次,以杀灭从空气中落入杂菌。

④余同上。



三、稀释方法

①从均质杯准确吸取样液1ml混匀的样液,然后沿管壁徐徐接种到含9ml磷酸盐缓冲液里,盖上试管塞后充分震荡混匀为1:100稀释液。(一定要枪头尖端伸入稀释液内2-3ml,以免吸入空气进入移液器,污染样品造成实验失败。)

③重复该操作,按需要配制1:1000、1:10000…稀释液。

④为减少样品稀释误差,在连续递增稀释时(原液在前稀释液在后),每一稀释液应充分振摇,使其均匀,同时每一稀释度应更换一个枪头。

⑤不要在稀释剂中吹洗吸管。



四、样液接种方法:

① 在无菌室,取出灭菌的枪头或者灭菌的移液器,

② 准确吸取样品匀液,1ml、1ml、1ml无菌操作分别以2~4s内完全注入已标识清楚的菌落总数平皿、大肠菌群以及金黄色葡萄球菌培养液中。

③  如果某一样品液在接种前放置时间超过3 min,应重新均质。

④ 为了验证稀释液、培养基、平皿、枪头等器具无菌需做空白对照。



五、倾注培养基

右手持培养基三角瓶(已放45℃的水浴中恒温)置火焰旁边,用左手拇指和食指或中指使平皿开启不超过30°,迅速倒人培养基约15-20ml,加盖后轻轻摇动培养皿,左三圈,右三圈,使培养基均匀分布在培养皿底部,然后平置于桌面。



六、培养

●  平皿倒置放入恒温培养箱中(每垛最多堆放6个平皿,平皿间要留有空隙进行空气流通,使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致),按所规定的时间温度进行培养。

●  斜面、高层斜面、液体培养基立在试管架上放入恒温培养箱中,按所规定的时间温度进行培养,



七、计数判定及注意事项

●由于细菌种类繁多,差别甚大。计数时一般用菌落计数器仔细观察。必要时用放大镜检查,以防遗漏尤其是平皿边缘生长的菌落。

●计数方法参照gb 4789.2-2016方法。

●稀释度低的培养皿,微生物菌落和食品碎渣很难区分,一般吸取过滤网过滤后的稀释液以减少食品碎渣的影响;

●为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆,不易分辨,可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板,不经培养,而于4℃环境中放置,以便计数时作对照观察。

● 必要时,为了防止食品颗粒与菌落混淆不清,可在平板计数琼脂中加入氯化三苯四氮唑ttc(100ml加入1ml 0.5%ttc),培养后菌落呈红色,易于分别。

● 在发酵试验中,发酵倒管的产气量,多者可以使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生比小米粒还小的气泡,或发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡,都应作进一步试验。如果对产酸但未产气的发酵有疑问时,可以用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮,就像啤酒中的二氧化碳气泡一样,即应考虑可能有气体产生,而应作进一步试验。