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食品中黄曲霉素快速检测方法简介

黄曲霉毒素b1(afb1)酶联免疫定量检测方法
一、黄曲霉素含义和检测原理:黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物,主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以afb1为主,afb1属于强烈致癌物质,肝脏是其主要的靶器官,具有极强的急性毒性和致癌性。afb1检测方法主要有薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)和elisa方法,本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的elisa检测方法,可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的afb1。测定原理才采用固相酶联免疫吸附原理,利用间接竞争elisa法进行测定。用抗原包被微孔板,加入afb1标准品或样品、抗afb1单克隆抗体进行孵育后,将未与包被抗原结合的抗体洗去;再加入酶标记的抗鼠igg抗体孵育,加入显色液,经过终止液终止后,用酶标仪在450nm处测定od值。

二、实验所需提供的耗材物品:微孔板包被有afb1-bsa5个浓度的afb1标准溶液(各0.5ml)。标准1:0ng/ml可直接使用;标准2:0.1ng/m可直接使用;标准3:0.2ng/ml可直接使用;标准4:0.5ng/m可直接使用;标准5:1.0ng/m可直接使用;抗af b1单克隆抗体溶液(6ml)可直接使用;酶标物(12ml)可直接使用;显色液(12ml)可直接使用;终止液(6ml)可直接使用;浓缩洗液(30ml) 稀释使用;微孔板酶标仪(可于450nm处测定)、振荡器、粉碎机、微量移液器;量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸;氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水或蒸馏水。

三操作者注意事项:1、标准溶液中含有黄曲霉毒素,应特别小心。2、使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用ph7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡过夜。3、终止液含有硫酸,避免接触皮肤。4、每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。5、每步加样时间应控制在5min内。6、孵育过程中应避光。不要交叉使用不同批号的试剂。实验试剂储存条件:保存试剂盒于2~8℃;不要冷冻.显色液对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下;将不用的微孔板放进原铝箔袋中,置2~8℃保存。

四、实验测试样品的处理:样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存;取5g粉碎的有代表性的样品,加1.25g氯化钠及25ml70%甲醇-水溶液;强力振荡3分钟;用快速定性滤纸过滤;取1ml滤液,加水4ml进行稀释;取50μl稀释液进行分析;根据需要可以增减样品量,但甲醇-水溶液的量也应相应增减。

五、检测实验中酶免疫分析程序:1、浓缩洗液为10倍浓缩液,使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。2、取所需数量的板条插入微孔架,用洗液洗涤微孔板3min×2次。3、加入50ml标准品或处理好的样品到微孔,记录样品及标准的位置,每个标准和样品必须使用新的吸头。4、加入50ml抗体溶液到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到孔中的液体,避免交叉污染)中,37℃孵育90min。甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。每孔加入酶标物100ml,37℃孵育60min。用洗液洗涤微孔板3min×5次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。5、每孔加入显色液100ml(2滴),37℃孵育10~12min。6、每孔加入终止液50ml(1滴),立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值(od值)。在定量分析中,显色液和终止液需要用移液器准确量取。

六、黄曲霉素检验实验样品浓度计算方法:以标准溶液od值与标准1od值的比值为纵坐标,所对应标准溶液浓度(ng/ml)的对数值为横坐标,制作标准曲线。根据样品od值与标准1od的比值,可从曲线上得到对应点的横坐标,即为afb1浓度的对数值,求得反对数即为测定液中afb1浓度c(ng/ml),按下列公式计算出样品中afb1含量:afb1含量(mg/kg)= c×k式中:c:稀释后样品提取液中afb1含量(ng/ml)k:样品稀释倍数(按照本说明书中样品处理程序方法为25)

七、试剂主要技术指标及参数

测试盒最低检出浓度0.1ng/ml,回收率70%~120%,与afb2的交叉反应系数小于1%,与afg1的交叉反应系数为4.65%,与afg2交叉反应系数小于1%。试剂盒校正曲线的线性范围0.1~1.0ng/ml,试剂盒条内变异<10%,条间变异<15%。

总黄曲霉毒素(afs)酶联免疫测试方法介绍
  一、黄曲霉素afs快速检测的意义:黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物。主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以afb1、afb2、afg1、afg2为主,总黄曲霉毒素一般指这四种毒素的总量。黄曲霉毒素属于最强烈的天然致癌物质,肝脏是其主要的靶器官,其中afb1毒性最强,具有极强的急性毒性和致癌性。其检测方法主要有薄层色谱法(tlc)和高效液相色谱法(hplc),本试剂盒可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的总黄曲霉毒素。

二、黄曲霉素测定原理:利用用固相酶联免疫吸附原理,利用间接竞争elisa法进行测定。用抗原包被微孔板,加入黄曲霉毒素b1标准品或样品、总黄曲霉毒素单克隆抗体进行免疫反应后,将未与包被抗原结合的抗体洗去;再加入酶标记的抗鼠igg抗体孵育,加入底物显色,终止液终止后,用酶标仪在450nm处测定od值。

三、快速检测实验操作所需的试剂及材料:微孔板 包被有afb1-bsa;5个浓度的afb1标准溶液各(1ml)可直接使用;标准1:0ng/ml 可直接使用;标准2:1.0ng/ml可直接使用;标准3:2.0ng/ml 可直接使用;标准4:5.0ng/ml可直接使用;标准5:10.0ng/ml 可直接使用;afs单克隆抗体溶液(6ml)可直接使用;酶标物(12ml)可直接使用;显色液(12ml);终止液(6ml);浓缩洗液(30ml) ;空白对照(6ml)微孔板酶标仪(含450nm):定量分析用;振荡器,粉碎机,微量移液器,量筒,漏斗和容量瓶,快速定性滤纸;试剂:氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水或蒸馏水

四、检验操作注意事项:标准溶液中含有黄曲霉毒素,应特别小心。使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用ph7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡过夜。终止液为0.5n硫酸,避免接触皮肤。不要交换使用不同批号盒中的试剂。

五、黄曲霉素检验实验样品前处理:样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存,取5g粉碎的有代表性的样品,加1.25g氯化钠及25ml70% 甲醇-水,强力振荡3分钟;用快速定性滤纸过滤;取1ml滤液,用1%氯化钠溶液稀释10倍;取50μl稀释液进行分析;据需要可以增加样品量,但甲醇溶液的量也应相应增加。

六、检验实验注意事项和测定程序:每次加样后立即将所有试剂放回2-8 ℃,每步操作时间控制在5min内, 孵育过程中应避光。测定程序1. 取所需数量的板条插入微孔架,记录样品及标准的位置。2. 加入50ml标准品或处理好的样品到微孔,每个标准和样品必须使用新的吸头。3. 将50ml抗总黄曲霉毒素单克隆抗体使用液加入到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到放进孔中的液体,避免交叉污染),在适当位置孔加空白对照液100ml,37℃孵育90min。4. 甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。5. 每孔加入酶标物100ml,37℃孵育60min。6. 甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。7. 每孔加入显色液100ml(2滴),37℃孵育10 min -12min。8. 每孔加入终止液50ml(1滴),立即用酶标仪在波长为450nm处测定吸光度值(od值)。

七、 样品浓度计算方法:以标准溶液od值与第一个标准(0ng/ml)od值的比值为纵坐标,所对应标准溶液浓度(ng/ml)的对数值为横坐标,制作标准曲线。根据样品od值与0ng/ml标准od的比值,从曲线上得到对应点的横坐标,即为afs浓度的对数值,求得反对数即为测定液中afs浓度c(ng/ml),按下列公式计算出样品中afs含量:

afs含量(mg/kg)= c×k

式中:c:测定液中afs浓度(ng/ml)

k: 测定液对样品的稀释倍数(本提取方法为50)