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革兰氏染色的基本原理及方法

革兰染色法是1884年由丹麦医师gram创立,直到现今,革兰氏染色法仍是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。



细菌先经碱性染料结晶紫染色,而后经碘液进行媒染,之后用酒精脱色,在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不被脱去,有的可被脱去,因此可把细菌分为两大类,前者叫做革兰氏阳性菌(g ),后者为革兰氏阴性菌(g-)。为方便进一步观察,脱色后可再用一种红色染料如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色,阴性菌则被重新染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数的球菌,以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应;弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现负反应。



革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别,染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢,不易脱色,阴性菌复合物结合程度底,吸附染料差,易脱色,这是染色反应的主要依据。



另外,阳性菌菌体等电点较阴性菌为低,在相同ph条件下进行染色,阳性菌吸附碱性染料很多,因此不易脱去,阴性菌则相反。所以染色时的染色液ph和染色时间等条件要严格控制。例如,在强碱的条件下进行染色,两类菌吸附碱性染料都多,都可呈正反应; ph很低时,则都可呈负反应。此外,两类菌的细胞壁等对结晶紫-碘复合物的通透性也不一致,阳性菌透性小,故不易被脱色,阴性菌透性大,易脱色。所以脱色时间、脱色方法也应严格控制。



革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是:



(一)涂片固定

在干净的载玻片中央滴加一滴蒸馏水,用接种环进行无菌操作,挑取培养物少许,置载玻片的水滴中,与水混合做成菌悬液并涂布成直径约1cm的薄层。为避免因菌数过多聚集成团,不利于观察细菌个体形态,可在载玻片一侧进行上述操作,而在另一侧再加一滴水,从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释,涂布成薄层。若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液,则直接涂布于载玻片上即可,如菌液浓度较大,也可使用水滴再进行一次稀释。



涂片最好在室温条件下使其自然干燥,有时为了使之干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯火焰上方较高的位置微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。



标本干燥后即进行固定,固定的目的有三个:

(1)杀死微生物,固定细胞结构。

(2)保证菌体能更牢固的粘附在载玻片上,防止标本水洗时被水冲洗掉。

(3)改变染料对细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色。



固定常常利用高温,手执载玻片的一端(涂有标本的远端),标本向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次,共约2s-3s,并不时以载玻片背面加热,载玻片背面触皮肤,以不觉过烫为宜(不超过60℃),待放置冷后,再进行染色。



(二)染色

在固定过的涂片菌膜上滴加草酸铵结晶紫染液,染色液应完全覆盖整个菌膜,染色1min。



(三)水洗

染色到一定的时间,拿住玻片使之成450角,用细小的水流把多余的染料冲洗掉,被菌体吸附的染料则保留。



(四)媒染

加碘液覆盖涂面染1 min。在媒染处理时,媒染剂与染料形成不溶性的化合物,可增加染料和细菌的亲和力。



(五)水洗,用吸水纸吸去水分

用细小的水流缓慢冲洗涂片上的染色液,用吸水纸吸干。



(六)脱色

加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色, 20 s~30 s后再进行水洗,吸去水分。



(七)复染

蕃红染色液染色10 s后, 自来水冲洗。



(八)干燥,镜检

染色的结果,革兰氏正反应菌体都呈紫色,负反应菌体都呈红色。



(1)水流冲洗时,将载玻片微微倾斜,让水流从涂菌处的上方而不要直接在涂菌处冲洗,同时应调小水流避免染色液飞溅。染色液如果滴在水池或桌面上,可以用84消毒液擦拭去掉颜色,但要注意84消毒液不可直接用于皮肤和衣物等。



(2)在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果,假阳性主要是由于脱色不完全

,可能是由于涂片过厚或者是结晶紫染色过度等,导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度,造成细胞壁通透性的改变,而出现假阴性结果;另外,细胞培养时间过长,可能已经有部分细胞发生死亡或自溶,也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性的结果。避免假阳性或假阴性的办法是在同一张载玻片上设置革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌) 和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)的对照与待染色的菌一起进行染色, 当对照菌呈现预期的染色结果时表明染色过程正常。



(3)所观察的细胞一般应用18 h~24 h的活力培养物。因为一此菌株随菌龄的变化在革氏染色反应和形态学上也会发生变化。