乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法 杯碟法
1 范围
本标准规定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物的检验方法。
本标准适用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质的检验。
本方法的检出限为4u/ml。
2 原理
该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 抑菌圈测量仪或测量尺。
3.2恒温培养箱：36℃±1℃。
3.3 高压灭菌器。
3.4 无菌培养皿:内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。
3.5 无菌牛津杯：外径(8.0士0.1) mm，内径(6.0士0.1) mm，高度(10.0士0.1) mm。
3.6 麦氏比浊仪或标准比浊管。
3.7 ph计。
3.8 无菌吸管：1ml（0.01ml刻度值），10ml（0.1ml刻度值）。
3.9 加样器:5μl～20μl，20μl -200μl及配套吸头。
4 培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682中规定的三级水。
4.1 试验菌种：藤黄微球菌(micrococcus luteus) cmcc(b) 28001，传代次数不得超过14次。
4.2 磷酸盐缓冲溶液：按附录a中a.1规定。
4.3生理盐水（8.5 g/l）：按附录a中a.2规定。
4.4 青霉素标准溶液：按附录a中a.3规定。
4.5 β-内酰胺酶标准溶液：按附录a中a.4规定。
4.6 舒巴坦标准溶液按附录a中a.5规定。。
4.7 营养琼脂培养基：按附录a中a.6规定。
4.8 抗生素检测用培养基ⅱ：按附录a中a.7规定。
5.操作步骤
5.1 菌悬液的制备
将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36士1℃培养18h-24 h，用生理盐水洗下菌苔即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×1010 cfu/ml，4 ℃保存，贮存期限2周。
5.2 样品的制备
将待检样品充分混匀，取1 ml待检样品于1.5 ml离心管中共4管，分别标为：a、b、c、d，每个样品做三个平行，共12 管，同时每次检验应取纯水1 ml加入到1.5 ml离心管中作为对照。如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释。如样品为酸性乳制品，应调节ph值至6-7。
5.3 检验用平板的制备
取90mm灭菌玻璃培养皿，底层加10 ml灭菌的抗生素检测用培养基ⅱ,凝固后上层加入5 ml含有浓度为1×108 cfu/ml藤黄微球菌的抗生素检测用培养基ⅱ,凝固后备用。
5.4 样品的测定
按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到样品及纯水中：
a 青霉素5 μl。
b 舒巴坦25 μl、青霉素5 μl。
c β-内酰胺酶25 μl、青霉素g5 μl。
d β-内酰胺酶25 μl、舒巴坦25 μl、青霉素5 μl。
混匀后，将上述a～d 试样各200 μl 加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36士1℃培养培养18～22 h ，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。
5.5 结果报告
纯水样品结果应为：（a）、（b）、（d）均应产生抑菌圈；（a）的抑菌圈与（b）的抑菌圈相比，差异在3 mm以内(含3 mm)，且重复性良好；（c）的抑菌圈小于（d）的抑菌圈，差异在3 mm以上(含3 mm)，且重复性良好。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定。
7.1 如果样品结果中（b）和、（d）均产生抑菌圈，且（c）与（d）抑菌圈差异在3 mm以上（含3 mm）时，可按7.1.1、7.1.2 判定结果。
7.1.1（a）的抑菌圈小于（b）的抑菌圈差异在3 mm以上(含3 mm),且重复性良好，应判定该试样添加有β- 内酰胺酶，报告β- 内酰胺酶类药物检验结果阳性。
7.1.2（a）的抑菌圈同（b）的抑菌圈差异小于3 mm，且重复性良好，应判定该试样未添加有β- 内酰胺酶，报告β- 内酰胺酶类药物检验结果阴性。
7.2 如果（a）和（b）均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再进行检测。
附 录 a
（规范性附录）
培 养 基
a.1 磷酸盐缓冲溶液（ph6.0）
无水磷酸二氢钾 8.0 g
无水磷酸氢二钾 2.0 g
蒸馏水 加至1000 ml
a.2 生理盐水（8.5 g/l）
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1000 ml
121℃高压灭菌15 min。
a.3 青霉素标准溶液
准确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为0.1 mg/ml的标准溶液。当天配制，当天使用。
a.4 β-内酰胺酶标准溶液
准确量取或称取适量β-内酰胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为16000 u/ml的标准溶液。当天配制，当天使用。
a.5 舒巴坦标准溶液
准确称取适量舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为1 mg/ml的标准溶液，分装后-20 ℃保存备用，不可反复冻融使用。
a.6 营养琼脂
蛋白胨 10 g
牛肉膏 3 g
氯化钠 5 g
琼脂 15-20 g
蒸馏水 1000 ml
将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，分装试管每管约5~8 ml，120℃高压灭菌15 min，灭菌后摆放斜面。
a.7 抗生素检测培养基ⅱ
蛋白胨 10 g
牛肉浸膏 3 g
氯化钠 5 g
酵母膏 3 g
葡萄糖 1 g
琼脂 14 g
蒸馏水 1000ml
将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，120 ℃高压灭菌15 min，其最终ph 值约为6.6。
本标准规定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物的检验方法。
本标准适用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质的检验。
本方法的检出限为4u/ml。
2 原理
该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 抑菌圈测量仪或测量尺。
3.2恒温培养箱：36℃±1℃。
3.3 高压灭菌器。
3.4 无菌培养皿:内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。
3.5 无菌牛津杯：外径(8.0士0.1) mm，内径(6.0士0.1) mm，高度(10.0士0.1) mm。
3.6 麦氏比浊仪或标准比浊管。
3.7 ph计。
3.8 无菌吸管：1ml（0.01ml刻度值），10ml（0.1ml刻度值）。
3.9 加样器:5μl～20μl，20μl -200μl及配套吸头。
4 培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682中规定的三级水。
4.1 试验菌种：藤黄微球菌(micrococcus luteus) cmcc(b) 28001，传代次数不得超过14次。
4.2 磷酸盐缓冲溶液：按附录a中a.1规定。
4.3生理盐水（8.5 g/l）：按附录a中a.2规定。
4.4 青霉素标准溶液：按附录a中a.3规定。
4.5 β-内酰胺酶标准溶液：按附录a中a.4规定。
4.6 舒巴坦标准溶液按附录a中a.5规定。。
4.7 营养琼脂培养基：按附录a中a.6规定。
4.8 抗生素检测用培养基ⅱ：按附录a中a.7规定。
5.操作步骤
5.1 菌悬液的制备
将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36士1℃培养18h-24 h，用生理盐水洗下菌苔即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×1010 cfu/ml，4 ℃保存，贮存期限2周。
5.2 样品的制备
将待检样品充分混匀，取1 ml待检样品于1.5 ml离心管中共4管，分别标为：a、b、c、d，每个样品做三个平行，共12 管，同时每次检验应取纯水1 ml加入到1.5 ml离心管中作为对照。如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释。如样品为酸性乳制品，应调节ph值至6-7。
5.3 检验用平板的制备
取90mm灭菌玻璃培养皿，底层加10 ml灭菌的抗生素检测用培养基ⅱ,凝固后上层加入5 ml含有浓度为1×108 cfu/ml藤黄微球菌的抗生素检测用培养基ⅱ,凝固后备用。
5.4 样品的测定
按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到样品及纯水中：
a 青霉素5 μl。
b 舒巴坦25 μl、青霉素5 μl。
c β-内酰胺酶25 μl、青霉素g5 μl。
d β-内酰胺酶25 μl、舒巴坦25 μl、青霉素5 μl。
混匀后，将上述a～d 试样各200 μl 加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36士1℃培养培养18～22 h ，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。
5.5 结果报告
纯水样品结果应为：（a）、（b）、（d）均应产生抑菌圈；（a）的抑菌圈与（b）的抑菌圈相比，差异在3 mm以内(含3 mm)，且重复性良好；（c）的抑菌圈小于（d）的抑菌圈，差异在3 mm以上(含3 mm)，且重复性良好。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定。
7.1 如果样品结果中（b）和、（d）均产生抑菌圈，且（c）与（d）抑菌圈差异在3 mm以上（含3 mm）时，可按7.1.1、7.1.2 判定结果。
7.1.1（a）的抑菌圈小于（b）的抑菌圈差异在3 mm以上(含3 mm),且重复性良好，应判定该试样添加有β- 内酰胺酶，报告β- 内酰胺酶类药物检验结果阳性。
7.1.2（a）的抑菌圈同（b）的抑菌圈差异小于3 mm，且重复性良好，应判定该试样未添加有β- 内酰胺酶，报告β- 内酰胺酶类药物检验结果阴性。
7.2 如果（a）和（b）均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再进行检测。
附 录 a
（规范性附录）
培 养 基
a.1 磷酸盐缓冲溶液（ph6.0）
无水磷酸二氢钾 8.0 g
无水磷酸氢二钾 2.0 g
蒸馏水 加至1000 ml
a.2 生理盐水（8.5 g/l）
氯化钠 8.5 g
蒸馏水 1000 ml
121℃高压灭菌15 min。
a.3 青霉素标准溶液
准确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为0.1 mg/ml的标准溶液。当天配制，当天使用。
a.4 β-内酰胺酶标准溶液
准确量取或称取适量β-内酰胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为16000 u/ml的标准溶液。当天配制，当天使用。
a.5 舒巴坦标准溶液
准确称取适量舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为1 mg/ml的标准溶液，分装后-20 ℃保存备用，不可反复冻融使用。
a.6 营养琼脂
蛋白胨 10 g
牛肉膏 3 g
氯化钠 5 g
琼脂 15-20 g
蒸馏水 1000 ml
将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，分装试管每管约5~8 ml，120℃高压灭菌15 min，灭菌后摆放斜面。
a.7 抗生素检测培养基ⅱ
蛋白胨 10 g
牛肉浸膏 3 g
氯化钠 5 g
酵母膏 3 g
葡萄糖 1 g
琼脂 14 g
蒸馏水 1000ml
将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，120 ℃高压灭菌15 min，其最终ph 值约为6.6。