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噬菌体滴度的测定的方法

在宿主细胞过量的情况下,噬斑的数量随着噬菌体的增加呈线性增加。由于这个原因,在感染以前,要将噬菌体进行稀释,而不是将宿主细胞稀释。以低moi(感染重复性)铺板,也可确保每一个噬斑仅包含一个dna 序列。
材料和试剂
1. 微波炉
2. lb/iptg/xgal培养 板
3. lb培养基
4. 顶层琼脂糖凝胶
操作步骤
1. 在5~10ml lb培养基中接种单个er2537克隆,振摇孵育直至对数生长中期(od600~0.5)
2. 在细胞生长时,微波融化顶层琼脂糖凝胶,分装至无菌培养管内,每管3ml。维持在45℃备用。
3. 37℃预热lb/iptg/xgal培养板,备用。
4. 以lb培养基10倍比稀释噬菌体。
建议稀释范围:对扩增的噬菌体培养上清,108-1011;对未扩增的筛选洗脱液,101-104。每次稀释都换用新的加样枪头,最好使用气溶胶阻隔枪头以避免交叉污染。
5. 一旦er2537培养物长至对数生长中期,分装至微量离心管中,每管200ml。
6. 将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中,一支微量离心管中仅加入一种稀释液10ml,快速涡旋,室温孵育1-5min。
7. 转移至含有45℃顶层琼脂糖凝胶的管中,快速涡旋混匀,立即倾倒至预热的lb/iptg/xgal平板上,轻缓摇动平板使顶层胶均匀分布。
8. 冷却平板5min,37℃倒置培养过夜。
9. 噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准,噬斑数乘以稀释度即可获得每10ml噬菌体的滴度-噬斑形成单位(pfu)。