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空气、食品接触面(餐具,饮具,器皿表面)微生物检验方法、检验标准

目的:

检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标,生产区域环境当中病原微生物的监控,达到规定标准,以控制食品成品的质量。


参照标准:

中华人民共和国国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》gb15979-1995、《haccp原理与实施》、中华人民共和国国家标准《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》gb/t 18204.1-2000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准sn 0169-92/sn 0172-92/ sn 0170-92、 出入境检验检疫局二000四年《出入食品微生物检验培训教材》中《出入食品生产厂卫生细菌检验方法》、日本东京冷冻食品检验方法。


采样与检测方法:

3.1空气的采样与测试方法
3.1.1样品采集:
(1)取样频率:
a)车间转换不同卫生要求的产品时,在加工前进行采样,以便了解车间卫生清扫消毒情况。
b)全厂统一放长假后,车间生产前,进行采样。
c)产品检验结果超内控标准时,应及时对车间进行采样,如有检验不合格点,整改后再进行采样检验。
d)实验性新产品,按客户规定频率采样检验。
e)正常生产状态的采样,每周一次。
(2)采样方法
在动态下进行,室内面积不超过30 m2,在对角线上设里、中、外三点,里、外点位置距墙1 m;室内面积超过30 m2,设东、西、南、北、中五点,周围4点距墙1 m。采样时,将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(约桌面高度),并避开空调、门窗等空气流通处,打开平皿盖,使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测,送检时间不得超过6h,若样品保存于0~4℃条件时,送检时间不得超过24h。
3.1.2菌落培养:
(1)在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37℃±1℃ 培养24 h,取出检查有无污染,将污染培养基剔除。
(2)将已采集样品的培养基在6 h内送实验室,细菌总数于37℃±1℃培养48h观察结果,计数平板上细菌菌落数。
(3)菌落计算:
a) 记录平均菌落数,用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数,标记或在菌落计数器上点计,然后用5~10倍放大镜检查,不可遗漏。
b) 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠,可分辨时仍以2 个或2个以上菌落计数。
3.2工作台(机械器具)表面与工人手表面采样与测试方法:
3.2.1样品采集:
(1)取样频率:
a)车间转换不同卫生要求的产品时,在加工前进行擦拭检验,以便了解车间卫生清扫消毒情况。
b)全厂统一放长假后,车间生产前,进行全面擦拭检验。
c)产品检验结果超内控标准时,应及时对车间可疑处进行擦拭,如有检验不合格点,整改后再进行擦拭检验。
d)实验新产品,按客户规定擦拭频率擦拭检验。
e)对工作表面消毒产生怀疑时,进行擦拭检验。
f)正常生产状态的擦拭,每周一次。
(2) 采样方法:
  a) 工作台(机械器具):用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面(取与食品直接接触或有一定影响的表面)取25cm2的面积,在其内涂抹10次,然后剪去手接触部分棉棒,将棉签放入含10ml灭菌生理盐水的采样管内送检。
b) 工人手:被检人五指并拢,用浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面,从指尖到指端来回涂擦10次,然后剪去手接触部分棉棒,将棉签放入含10ml灭菌生理盐水的采样管内送检。
(3)采样注意事项:
擦拭时棉签要随时转动,保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间
3.2.2细菌·大肠菌群的检测培养:
样液稀释:将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1:10稀释液。如污染严重,可十倍递增稀释,吸取1ml 1:10样液加9ml无菌生理盐水中,混匀,此液为1:100稀释液。
3.2.2.1 细菌总数:
(1)以无菌操作,选择1~2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿(平行样),将已融化冷至45℃左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿,每皿约15ml,充分混合。
(2)待琼脂凝固后,将平皿翻转,置36℃±1℃ 培养48 h后计数。
(3)结果报告:报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数
3.2.2.2大肠菌群:
(1)平板法:
a) 以无菌操作,选择1~2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿(平行样),将已融化冷至45℃左右的去氧胆酸盐琼脂培养基倾入平皿,每皿约15ml,充分混合。待琼脂凝固后,再覆盖一层培养基,约3-5 ml。
b) 待琼脂凝固后,将平皿翻转,置36℃±1℃ 培养24h后计数。
c) 结果计算: 以平板上出现紫红色菌落的个数乘以稀释倍数得出。
d) 结果报告:报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数
(2)试管法:
a) 以无菌操作,选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到bglb肉汤培养基中,每个稀释度接种三管。
b) 置bglb肉汤管于36℃±1℃培养48±2h。记录所有bglb肉汤管的产气管数。
c) 结果报告:按bglb肉汤管产气管数,查mpn表报告每25cm2食品接触面中或每只手的大肠菌群值。
3.2.3金黄色葡萄球菌检测
(1)定性检测
a)  取1ml稀释液注入灭菌的平皿内,倾注15-20ml的b-p培养基,(或是吸取0.1稀释液,用l棒涂布于表面干燥的b-p琼脂平板),放进36±1℃的恒温箱内培养48±2小时。
b) 从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌的菌落作血浆凝固酶实验。
c)  结果报告:b-p琼脂平板的可疑菌落作血浆凝固酶实验为阳性,即报告手(工器具)上有金黄色葡萄球菌存在。
(2)定量检测
a)  以无菌操作,选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到含10﹪氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤培养基中,每个稀释度接种三管。
b)  置肉汤管于36±1℃的恒温箱内培养48小时。划线接种于表面干燥的b-p琼脂平板,置36℃±1℃ 培养45~48小时。
c)  从b-p琼脂平板上,挑取典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落接种肉汤培养基,36℃±1℃培养20~24小时。
d)  取肉汤培养物做血浆凝固酶试验,记录试验结果。
e)  报告结果:根据凝固酶试验结果,查mpn表报告每25 cm2食品接触面中或每只手的金黄色葡萄球菌值。
3.3工厂环境中病原体的检测计划与方法
检测计划:为了保证食品安全,工厂应该对生产环境中的病原微生物进行检测和评估,检测项目包括李斯特菌,沙门氏菌等病原体微生物,化验室应该按照一定的计划对生产场所环境中的病原体进行检测,其中包括地面、下水道、排水沟、墙壁、天花板、设备框架、运输的支架,冷藏装置、速冻机、传送带、设备的螺丝、维修工具等部位。当某个点检测到病员微生物时,应该对环境中的相似点加大检测频率;在把所有的预定点检测完后,应该对环境中的病原微生物的存在状况进行全面评估,在下一次环境检测循环过程中加强检测容易出现病原体的环境点,达到持续改进的目的。
检测频率: 每月两次,每次每个区域至少选取5个检测点,分别进行检测。
3.3.1环境李斯特菌的检测方法(3mtm  petrifilmtm 环境李斯特菌的测试片)
3.3.1.1 用涂抹棒,海绵或者其他采样设备收集环境样本。
3.3.1.2 将收集的样本添加10毫升灭菌的缓冲蛋白胨水,将样本与缓冲蛋白胨混合1分钟,将样品置于室温(20-30℃)1小时,最久不超过1.5小时,以修复损伤的李斯特菌。
3.3.1.3 将测试片放在平坦处,掀起上层膜。
3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升样品到下层膜中央,将上层膜缓慢盖下,以免产生气泡。
3.3.1.5 轻轻将塑料压板放在位于接种区上层膜上,不要压,扭转或者滑动压板。提起压板等至少十分钟,以使胶体凝固。
3.3.1.6 将测试片透明面朝上,可叠放至十片,在37℃±1℃培养26-30小时,可以用标准菌落记数器或者其他光学放大器判读,不要记数圆形轮廓上的菌落,因为他们不受选择性培养基的影响。
3.3.1.7 对于定性检测,根据紫红色菌落是否存在,结果记为检出或者未检出。
3.3.2环境中沙门氏菌的检测方法
3.3.2.1采样地点: 选取采样点时因尽量选取微生物容易滋生的地方


冷冻车间

fd车间

东区初加工

传递窗口表面、排水沟、
排水沟出口、墙壁、地面

卸料间

墙壁、墙角、地面、天花板、
物料车表面

东区精加工

地面、墙壁、墙角、排水沟、
排水沟出口、速动机链条、天花板

暂存间

墙壁、地面、天花板、墙角、墙缝

西区初加工

传递窗口表面、地面、墙壁、
排水沟、排水沟出口

挑选间

墙壁、地面、天花板、墙角、垫板

西区精加工

地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板

包装室

墙壁、地面、天花板、金探传送带表面、落地料存放处

3.3.2.2 操作步骤
3.3.2.2.1采样应在生产开始后进行,用已浸润过的棉拭在选定的被测表面旋转涂抹约100cm2的面积,然后将棉拭放回涂抹试管并盖紧。       
3.3.2.2.2将样品带回实验室,每5个点混合成一个样品, 登记编号,按照sn0170-92标准及时检测,若有阳性结果出现,应逐步对所混合的每个点分别检测。
物体表面涂抹菌落总数计算方式:物体表面细菌总数(cfu/c㎡)=平皿上菌落的平均数*采样液稀释倍数/采样面积(cm2)
根椐gb15979-2002《一次性卫生用品卫生标准》的标准,生产环境卫生指标
1 装配与包装车间空气中细菌菌落总数应≤2 500 cfu/m3。
2 工作台表面细菌菌落总数应≤20 cfu/cm2。
3. 工人手表面细菌菌落总数应≤300 cfu/只手,并不得检出致病菌。
人员和环境卫生检测方法
一、        空气采样及检验方法
1培养基:普通营养琼脂平板,按gb4789.28中3.7条配制
2采样(空气沉降法)
2.1布点:面积小于30平方米的车间,设一对角线,在线上取3点,即中心一点,两端在距墙1米处各取一点;面积大于30平方米的车间,设东、西、南、北、中5个点,其中东、西、南、北点均距墙1米。
2.2采样高度:与地面垂直高度80-150厘米。
2.3采样方法;用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。
3培养:于37℃培养24小时。
4检测频率:每周
空气质量标准:
生车间、熟车间、成品车间:低于100个
半成品库、成品库:低于10个
二、设备的采样与检验方法
根据生产过程所要求的重点卫生部位,实验室对其进行涂抹采样,进行细菌总数检验。
1采样方法
1.1涂抹法(适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面)
取经过灭菌的铝片框(框内面积为50平方厘米)放在需检查的部位上,用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分,擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中,此液每毫升代表5平方厘米。
1.2贴纸法(适用于表面不平坦的设备和工器具接处面)
将无菌规格纸(5×5厘米,纸质要薄而软)用无菌生理盐水泡湿后,于需测部分分别贴上两张,两张纸面积共50平方厘米,然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中,此液每毫升代表5平方厘米。
2检验方法
2.1细菌总数的检验
将上述样液充分振摇,根据卫生情况,相应地做10倍递增稀释,选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养,培养基用普通营养琼脂,每个稀释度作2个平皿,每个平皿注入1毫升样液,于37℃培养24小时后计菌落数。
结果计算
表面细菌总数(cfu/cm2)=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×2
2.2致病菌的检验
沙门氏菌,参照gb4789.4进行
金黄色葡球菌,参照gb7918.5进行
4.检验合格标准:细菌总数10-100个∕cm2,
5.关键点:细菌总数≤10个∕cm2
一般区域:细菌总数≤100个∕cm2
三、人员手表面细菌污染情况的检验
1.        采样方法:用一支蘸有无菌生理盐水的棉拭子涂擦被检对象手的全部,反复两次,涂擦的时候棉拭子要相应地转动,擦完后,将手接触部分剪去,将棉拭子放入装有10毫升无菌生理盐水的试管内送检培养。
2.        检验方法:同工器具表面细菌总数检验方法。
3.        结果计算:每只手表面的细菌总数(cfu/只手)=平皿上菌落的平均数× 样液稀释倍数
四、消毒液药效的微生物学鉴定法
1采样对象:正常使用的消毒液,和已知配制好备用的消毒液
2采样及检验方法
在无菌条件下,用无菌吸管吸取1毫升样液,加入9毫升稀释液中混匀,对于醇类与酚类消毒剂,稀释液用普通营养肉汤即可;对于含氯消毒剂、含碘消毒剂,需在肉汤中加入0.1%硫代硫酸钠,对洗必泰、季铵盐类消毒剂,需在肉汤中加入3%(w/v)土温80和0.3%卵磷脂;对醛类消毒剂,需在肉汤中加入0.3%甘氨酸;对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂,需在肉汤中加入(w/v)土温80,以中和被检样液中的残效作用,
将注入了样液的稀释液充分摇匀,取1毫升注入平皿,随之倒入普通营养琼脂,待琼脂凝固后,翻转平皿,将平皿于37℃条件下培养24小时后计平板上生长的菌落数。
3结果分析
平板上有菌生长,表明被检样液中有残存活菌,若每个平板菌落数在10个以下,仍可用于消毒,若每个平板菌落数超过10个,说明每毫升被检样液含菌量已超过100个,即不宜在用于消毒。
该公式是一个经验公式.它的理论模式依据是:100cm2的面积上10min降落的菌落数,
等于1升空气中所含的细菌总数.系数50000基于上述假说和单位换算而来.
细菌总数(cfu/m3)=5/10t*100/a*1000*n=50000*n/at
    5/10t:实际放置了5min;
    100/a:a单一培养皿面积;
    1000:1m3=1000l啊,换算成m3
1、空气细菌落菌数单位既然是cfu/m3,那采样时应该还要记录放置平皿的高度。
2、食品安全管理体系中罐头行业有个标准如下:
   落下菌数      空气污染程度      评价
   30以下          清洁           安全
   30~50               中等清洁     
   50~70               低等清洁        应加注意
   70~100             高度污染        对空气要进行消毒
   100以上       严重污染        禁止加工
3、是否可根据企业相应的加工产品微生物指标进行自行制定?