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真菌的dna和rna提取方法

一、真菌dna的提取(方法一)
1.实验试剂
(1)dna提取液:0.2m tris-hcl(ph 7.5),0.5m nacl,0.01m edta,1%sds
(2)3m naac
(3)te:10 mmol/l tris-hcl ph8.0,1 mmol/l edta
(4)酚(ph8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)异丙醇
(7)无水乙醇
(8)75%乙醇
(9)rnasea
2.实验步骤
(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4ml提取液,快速振荡混匀
(3)加入等体积的4ml的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)
(4)1000rpm,4℃,5min
(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)
(6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul te中
(8)加入1ul rnasea (10mg/ml),37℃处理1h
(9)用酚(ph8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
(10)取上清,1/10v 3m naac,2.5v体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul te中,-20℃保存备用

二、真菌dna的提取(方法二)
1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3ml 65℃预热的dna提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次
3.加入1ml 5m kac,冰浴20min
4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul te中
7.加入1ul rnasea(10mg/ml),37℃处理1h
8.用酚(ph8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
9.取上清,1/10v 3m naac,2.5v体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul te中,-20℃保存备用
dna提取缓冲液:100mm tris-hcl(ph8.0),20mm edta(ph8.0),1.5m nacl,2% ctab(w/v),4% pvp40(w/v)和2%巯基乙醇(v/v),pvp和巯基乙醇使用前加入5m kac
    方法一和二,是大同小异.主要是dna提取液配方不一样!成本也不一样!
三、真菌菌丝的总rna的提取
1.实验试剂
(1)rna提取缓冲液(ctab):2% ctab(w/v),2% 聚乙烯吡咯烷酮pvp(w/v),100mm tris-hcl(ph8.0,depc处理的水配置),25mm edta,0.5g/l 亚精胺spermidine,2.0m nacl,2%巯基乙醇(v/v,使用前加入).由于在高温灭菌条件下,tris-hcl要和depc发生反应,所以配rna提取缓冲液时直接用depc 处理的水配制即可
(2)sste:1 m nacl,0.5% sds(w/v),10mm tris-hcl ph8.0,1.0mm edta
(3)10m licl 直接用蒸馏水配10m licl,加1‰的depc过夜后,高温灭菌
(4)3m naac
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)酚(ph4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(7)depc处理水 用1‰的depc处理蒸馏水过夜,高温灭菌
(8)无水乙醇;70%酒精
2.实验步骤
(1)实验开始前将rna提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入me(巯基乙醇),(10ml加80ul,50ml中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50ml离心管,按1g材料8ml的量加入预热的rna提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚ph4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4v体积10m licl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul sste溶解沉淀
(9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2v体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的depc处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测rna的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
注意:提取rna请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短.