微生物检验常见问题问答-ag捕鱼平台

ag捕鱼平台主页 > 技术知识 >

微生物检验常见问题问答

问、灭菌锅化学检验和生物检验是每次实验都需要做吗?还是定期检验一下灭菌锅的性能呢?
答:化学法是每次都要做的,生物法可以定期做,根据灭菌锅的使用频率,每周、每半月或每月做一次即可。



问:沙氏葡萄糖琼脂培养基(sda)上会不会生长细菌?
答:sda不是选择性培养基,而是一种广谱的增菌培养基,ph范围5.4-5.8,某些细菌是可以在sda上生长的,霉菌和酵母菌总数计数时sda上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数;或者可以经过评估选择含有抗生素(如氯霉素)的sda或者玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。





问:琼脂培养基为什么需要倒置培养?
答:在进行微生物培养时,若正置培养,琼脂培养基中的水分易蒸发使平板干裂,不利于微生物的生长;同时水蒸汽会在平皿盖上形成冷凝水,若回落在培养基表面,会使菌落蔓延生长,无法计数,若冷凝水太多会使培养基与平皿分离,容易滑动倒置培养可减少培养基表面的空气流动,减慢培养基中水分蒸发的速度,充分维持弹性,有利于菌株的生长和繁殖,防止空气中杂菌对培养基及培养物造成污染;也会由于重力作用在一定程度上使营养物质沉积到培养基表面,有利于微生物利用营养物质;倒置的平板方便拿取,避免环境中杂菌的污染。

需要注意的是,《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》(gb4789.15-2016)是要求正置培养,而非倒置,以防霉菌孢子形成次生菌落,影响计数结果。



问:食品企业的环境检测应该依据那个标准?
答:gb/t16294-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》都有规定,可以做为参考。





问:请问高压灭菌锅需要操作人员有压力容器操作证吗?有些人说属于《特种设备安全监察条例》需要操作证?
答:cnas-cl 01-a001: 2018的 6.2.2.2条款里有说讲到,如实验室使用的高压蒸汽灭菌器不属于简单压力容器(定义参见tsg r0003 -2007《简单压力容器安全技术监察规程》)时,操作人员需持有特种作业人员证。



问:
答:开瓶后的培养基,如果长时间不使用,还在效期内,建议开瓶后间隔1年进行复验。如果出现结块,则不能使用。同理,如果同一批次一次购买量较多,一年内未使用完,也建议进行复检。



问:控制菌检查法中用到的培养基,在做培养基适用性的时候,其中有“指示特性”的表述,那么“指示特性”是指的什么意思?
答:培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况(菌落颜色变化)等。例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在xld有黑心等。





问:什么是不可接受微生物?

答:不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的,存在足够的数量,通过产品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。如何确定一种微生物是不可接受的,需要进行风险分析,包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者潜在影响等。





问: 培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌参数进行,是否可行?

答:可以。厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用,使用单位也可以根据自己实验室的实际情况,在相关法规要求内,使用自己验证过的灭菌参数来执行。

【法规来源:中国药典2020版9203药品微生物实验室质量管理指导原则   ……培养基灭菌应按照生产商提供或使用者验证的参数进行……】



问:革兰氏染色有哪些注意事项?
答:(1)最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色,培养时间过久的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。

(2)挑取适量的菌,不宜过多,均匀涂开。

(3乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键,15-30s为宜,脱色不够可能会造成假阳性,脱色过度可能会造成假阴性。






问:如何根据实验需要制备斜面?

答:根据实验需求,摆放斜面一般有三种形式:

(1)长斜面:斜面底部刚覆盖试管底部,上部距管口2.5-3cm左右;例如tsa传代斜面。

(2)高层斜面:斜面与底层高度约为2:3,即底部高约3cm,斜面长度约2cm;如三糖铁高层斜面。

(3)普通斜面:斜面底部距试管底部约1cm,上部距管口约2.5-3cm。





问:三糖铁培养基颜色变化原理是什么?

答:该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1,只能利用葡萄糖的细菌,分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面后来又变红,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌则产生大量的酸,使整个培养基呈现黄色。如菌种接至培养基培养后产生黑色沉淀,是因为某些细菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氢,硫化氢和培养基中的铁盐反应,生成黑色的硫化亚铁沉淀。



问:如果三糖铁上斜面红色、底层黄色,中间有黑色且产气,能否判定为沙门菌?
答:不能。某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜色变化,例如奇异变形杆菌。如三糖铁上有上述颜色变化,需要进一步的进行适宜的鉴定试验,确证是否为沙门菌。

如果采用传统的生化鉴定,可参考gb 4789.4-2016中沙门氏菌检验的方法。






- 问答 -
gb 4789系列什么情况下应作阳性对照,假如检测50批样品致病菌都是阴性结果,需要人工污染样品做阳性对照来做质控吗?

答:gb 4789.1里规定要定期进行,没有明确说什么时候进行。自己实验室需要制定sop进行规定,比如我们实验室总是检出某个致病菌的阳性结果,就规定一个月的时间来进行阳性对照。保证实验室人员具有可以持续进行阳性检出的能力的。最新的rb/t 038-2020 食品微生物检测结果质量监控指南文件里规定:对于日常质量监控,应执行检测方法的规定,否则建议每批或每组样品每20个样品1次的频次进行;质控不一定需要人工污染样品来做,可以用标准菌株来做阳性和阴性对照。








- 问答 -
商品化的即用培养基(比如血平板平皿),有供应方的验收报告和cma报告,购入后实验室是否还需要做验收吗?商品化基础培养基中需要添加的配套添加剂是否需要进行验收吗?如何验收呢?

答:目前的标准需要做,配套添加剂不需要单独验收。








- 问答 -
关于培养基性能测试,我们公司也有文件要求,我们平时做培养基性能测试除了参考gb4789.28外,可不可以也参考我们的文件做验收?

gb4789.28是一个最低的标准,一定要达到。比如ec肉汤只写了大肠埃希氏菌和粪肠球菌这两的菌株,必须要达到,如果企业自己的验收标准(里包含了国家标准里的菌株)高于国家标准,那就更好。






- 问答 -
在琼脂培养基制备过程中,发现灭菌后的培养基制成的平板部分偏软甚至有不凝固的现象,是什么原因?

答:主要是琼脂分布不均导致的。建议琼脂类培养基灭菌前加热溶解均匀(如果是大体积配制进行分装灭菌的培养基,建议煮沸溶解,搅拌分装);灭菌后,使用前,关注培养基的透光性是否均一,如果不均一,轻轻摇晃使其均匀,再倾注平皿使用。







- 问答 -
平板在培养箱中培养后,平板干裂,缩水是什么原因?如何避免?



平皿干裂缩水,与琼脂的保水性、倾注培养基的量、平皿的透气性、培养箱条件等因素均有关系。

a.琼脂:不同的琼脂在保水性方面略有差异,保水性差的琼脂可能会出现严重缩水或者干裂。

b.培养基的量:倾注的培养基越少,平板越薄越容易干裂。按照gb4789要求,倾注融化的培养基到平皿中,使之在平皿中形成厚度至少为3 mm(直径90 mm的平皿,通常要加入18 ml~20 ml琼脂培养基)。如果平板需储存,或者培养时间超过48 h或培养温度高于40 ℃,则需要倾注更多的培养基。

c.平皿的透气性:平板的密封性越好,保存和培养过程中培养基失水越少。虽然增加平板的密封性可以减少水份流失,但并非密封性越高越好,一些需氧型微生物(如铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等),在密闭环境中生长较差,需要良好的透气性才能较好的生长。

d. 培养条件:培养箱是影响平皿干裂问题的关键因素之一。大型的培养箱为了保证内部温度均一,通常带有较强的鼓风系统,内部有较强的空气流动。而气流越强,则越容易导致平皿失水。而对于一些没有鼓风系统的小型培养箱,则很少会出现平皿干裂现象。在培养箱内摆放平皿时,应尽量避开风口气流大的位置,同时远离培养箱内部发热板。

综上所述,在遇到平板干裂缩水问题时,可通过增加平板培养基厚度、培养箱内增加挡板降低气流或避开风口、选择合适透气性的平皿、选择适宜琼脂的的培养基等进行综合的考虑分析,制定对应的方案和措施。






- 问答 -
灭菌后的琼脂培养基若未用完,可以下次再重新融化继续使用吗?

答:《gb4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出,含有活性化学物质或不稳定性成分的固体培养基也应即配即用,不可二次融化;因此对于一些已添加抗生素、卵黄、血清等不稳定成分的培养基,不可以再次融化使用。而对于一般的培养基(未开封启用),可使用沸水浴或采用有相同效果的方法使培养基融化,再次融化后未用完的培养基则不能重新凝固留待下次使用。








- 问答 -
标准菌株存活性怎么进行?

答:标准菌株存活性就是其的复活过程,我们购买的标准菌株一般是冻干粉或者冻干管,然后我们要对其进行复活培养,这个过程是必须的,否则我们没有办法使用。针对其存活性的验证,所有的标准法规中都是其存活性的判断,一个定性的判断。复活的过程对其进行打管,按照标准要求进行培养,如果接种到液体培养,有肉眼可见的浑浊或者进一步镜检时有目标微生物生长;如果接种到固体培养上,有肉眼可见的菌落,这些都叫存活性合格。






- 问答 -
实验室多久做一次沉降菌检测,哪个标准有规定?


答:每两周要做一次沉降菌检测包括操作台和房间的,方法可以参照gb/t 16294-2010,gb/t 27405-2008《实验室质量控制规范食品微生物检测 食品微生物检测》附录中有规定。








- 问答 -
实验室紫外灯怎么清洁?使用多久需要换新的紫外灯?还是说只要能用就不需要更换?


答:紫外线杀菌灯可以用纱布沾上75%酒精擦拭表面。紫外灯都有使用寿命,对于洁净室、生物安全柜等最好能够记录紫外灯的使用时间,到时间后必须更换。再就是根据定期的沉降菌监测情况更换紫外灯。






- 问答 -
灭菌后的琼脂培养基,是否可以在恒温箱或者恒温水浴锅过夜或更长时间存放?对培养基性能会有影响吗?


答:《gb4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出,融化后的培养基放入47~50℃的恒温水浴锅中冷却保温(可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度),直至使用,培养基达到47℃~50℃的时间与培养基的品种、体积、数量有关。融化后的培养基应尽快使用,放置时间一般不应超过4 h。



长时间的保温可能会造成培养基的营养成分流失,灵敏度下降,培养效果变差,琼脂的凝胶强度降低等情况,保温过夜或更长时间这种操作方法不是很规范。一般建议在满足试验安排的情况下,恒温存放的时间越短越好。