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总糖测定的原理和方法

一、糕点、糖果中还原糖的测定



1、直接滴定法

1)原理:样品经除去蛋白质后,在加热条件下,直接滴定经标定的碱性酒石酸铜溶液,还原糖将二价铜还原为氧化亚铜。以亚甲基蓝为指示剂,在终点稍过量的还原糖将蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝,根据试样所消耗的体积计算还原糖的含量。

直接滴定法已经过多次改进,只要严格遵守实验条件,分析结果的准确度和重现性是能够满足定量分析的要求。

2)试剂

①费林氏剂甲液:称取15g硫酸铜(cuso4·5h2o)及0.05g四甲基蓝,溶于水中并稀释至1000ml。

②费林氏剂乙液:称取50g酒石酸钾钠及75gnaoh,溶于水中,再加入4g亚铁氰化钾,完全溶解后,用水稀释至1000ml,贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

③乙酸锌溶液:称取乙酸锌结晶21.9g,加3ml冰醋酸,加水溶解至100ml。

④106g/l亚铁氰化钾溶液。

⑤葡萄糖标准溶液:准确称取1.0000g经过96±2℃干燥2h的纯葡萄糖,加水溶解后加入5mlhcl,并以水稀释至1000ml。此溶液每1ml相当于1.0mg葡萄糖。

3)操作方法

①样品处理:准确称取样品(粉碎后的)2.5~5.0g置于250ml容量瓶中,加水50ml,摇匀后慢慢加入5ml乙酸锌溶液,混匀后再慢慢加入5ml亚铁氰化钾溶液,振摇,加水定容并摇匀后静置30min,用干滤纸过滤,弃去初始滤液,过滤液备用。

②标定碱性酒石酸铜溶液:吸取5.00ml碱性酒石酸铜甲液及5.00ml碱性酒石酸铜乙液,置于250ml锥形瓶中,加水10ml,加入玻璃珠3粒,从滴定管加约9ml标准葡萄糖液,使其在2min内加热至沸。趁热以0.5滴/s的速度继续滴加糖液,直至溶液颜色刚好褪去为终点,记录消耗葡萄糖液的体积。平行操作3次,得m平均消耗葡萄糖液的体积。

计算每10ml(甲、乙各5ml)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg),即

m=v×c

式中m——10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)

v——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积

c——葡萄糖标准溶液的浓度(mg/ml)

③样品溶液的预测定:吸取费林氏甲、乙液各5ml,置于150ml三角瓶中,加水10ml、玻璃珠2粒,控制在2min内加热至沸,趁沸以先快后慢的速度,从滴定管中加样液,趁沸以0.5滴/s的速度继续滴定至蓝色刚好褪去为终点,记录消耗样液的体积。

④样品溶液的测定:吸取费林氏甲、乙液各5ml,置于150ml三角瓶中,加水10ml、玻璃珠2粒,从滴定管中加入比预测定体积少1ml的样液,使其在2min内加热至沸,趁沸以0.5滴/s的速度继续滴定至蓝色刚好褪去为终点,记录消耗样液的体积。同法平行操作3次,得出平均消耗样液的体积。

4)结果计算

w(还原糖)=m1×100×250/(m×v×1000)=25×m1/(m×v)

式中:w(还原糖)——还原糖的质量分数(%)

m——样品的质量 (g)

v——测定时平均消耗样品溶液的体积 (ml)

m1——10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量 (mg)

250——样品溶液的总体积 (ml)

5)说明

①醋酸锌及亚铁氰化钾作为蛋白沉淀剂;碱性酒石酸铜甲、乙液应分别配制,分别储存,不能事先混合储存。

②测定中的滴定速度、加热时间及热源稳定程度、锥形瓶壁厚度对测定精密度影响很大,在预测及正式测定过程中试样条件应力求一致。平行测定的样品溶液所消耗体积相差应不超过0.1ml。

③整个滴定过程应保持在微沸状态下进行,继续滴定终点的体积应控制在0.5~1ml之内,否则应重做。

④样品中还原糖的质量分数不宜过高或过低,需根据预测加以调节,以0.1%为宜。

⑤滴定至终点,指示剂被还原糖所还原,蓝色消失,呈淡黄色,稍放置,接触空气中的氧,指示剂被氧化,会重新变成蓝色,此时不应再滴定。

⑥配制标准液的葡萄糖应先在50~60℃下干燥30min然后置于98~100℃烘箱中烘至恒重。

⑦碱性酒石酸铜的氧化能力较强,可将醛糖和酮糖都氧化,所以测得的是总还原糖的质量。

⑧本法对糖进行定量的基础是碱性酒石酸铜溶液中cu2 的量,所以,样品处理时不能采用cuso4,naoh作为澄清剂,以免样液中误入cu2 得出错误的结果。

⑨在碱性酒石酸铜乙液中加入亚铁氰化钾,是为了使所生成的cu2o红色沉淀与之形成可溶性的无色络合物,使终点便于观察。

⑩次甲基蓝也是一种氧化剂,但在测定条件下其氧化能力比cu2 弱,故还原糖先与cu2 反应,待cu2 完全反应后,稍过量的还原糖才会与亚甲基蓝发生反应,溶液颜色消失,指示到达终点。

2、高锰酸钾法

该法是国家标准分析方法,它适用于各类食品中还原糖的测定,对于深色样液也同样适用。这种方法的主要特点是准确度高,重现性好,这两方面都优于直接滴定法。但操作复杂、费时,需查特制的高锰酸钾法糖类检索表(见附录)。

1)原理:将还原糖与过量的碱性酒石酸铜溶液反应,还原糖使二价铜还原为氧化亚铜。经过滤取得氧化亚铜,用fe2(so4)3溶液将其氧化溶解,而三价铁盐被还原为亚铁盐,再用高锰酸钾标准液滴定所产生的亚铁盐。根据高锰酸钾标准溶液的消耗量计算氧化亚铜的质量,从附录中查得与氧化亚铜量相当的还原糖量,再计算样品中的还原糖含量。

2)试剂

①碱性酒石酸铜甲液:称取35.639g硫酸铜(cuso4·5h2o),加适量水溶解,加0.5ml浓h2so4,再加水稀释至500ml,用精制石棉过滤。

②碱性酒石酸铜乙液:称取173g酒石酸钾钠及50gnaoh,加适量水溶解,并稀释至500ml,用精制石棉过滤,贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

③精制石棉:先将石棉用3mol/lhcl浸泡2~3h,用水洗净;再用100g/lnaoh溶液浸泡2~3h,倾去溶液,之后用碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时,用水洗净;再以3mol/lhcl浸泡数小时,以水洗至不呈酸性。然后加水振摇,使其成微细的浆状软纤维,用水浸泡并贮存于玻璃瓶中,即可用作填充古氏坩埚用。

④0.02mol/l高锰酸钾标准溶液:称取3.3g高锰酸钾溶于1050ml水中,缓缓煮沸20~30min,冷却后置于暗处密闭保存数日,用垂融漏斗过滤,保存于棕色瓶中。用基准草酸钠标定其准确浓度。

⑤1mol/lnaoh溶液:称取4gnaoh,加水溶解并稀释至100ml。

⑥fe2(so4)3溶液:称取50g fe2(so4)3,加入200ml水溶解后,慢慢加入100ml h2so4,冷却后加水稀释至1000ml。

⑦3mol/lhcl:量取30ml浓hcl,加水稀释至120ml。

3)仪器

①25ml古氏坩埚或g4垂融坩埚。

②真空泵或水力真空管。

4)测定方法

①样品处理

a、乳及乳制品、含蛋白质的冷食类:称取约2~5g固体样品(25~50ml液体样品)置于250ml容量瓶中,加50ml水,摇匀后加10ml碱性酒石酸铜甲液及4ml1mol/lnaoh溶液至刻度,混匀,静置30min,用干燥滤纸过滤,弃去初滤液,滤液供测定用。

b、酒精性饮料:吸取100ml样品,置于蒸发皿中,用1mol/lnaoh溶液中和至中性,蒸发至原体积的1/4后,移入250ml容量瓶中。加50ml水,混匀。以下按a项“加10ml碱性酒石酸铜甲液”起,依同样方法操作。

c、含淀粉较多的食品:称取10~20g样品,置于250ml容量瓶中,加200ml水,在45℃水浴中加热1h,并时时振摇,冷却后加水至刻度,混匀,静置。吸取20ml上清液置于另一250ml容量瓶中。以下按a项“加10ml碱性酒石酸铜甲液”起,依同样方法操作。

d、汽水等含co2的饮料:吸取100ml样品置于蒸发皿中,在水浴上除去co2后,移入250ml容量瓶中,并用水洗涤蒸发皿,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀后备用。

②测定:吸取50ml处理后的样品溶液置于400ml烧杯内,加25ml碱性酒石酸铜甲液及25ml乙液,盖上表面皿,置电炉上加热,使在4min内沸腾,再准确沸腾2min,趁热用g4垂融坩埚或铺好石棉的古氏坩埚抽滤,并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀,至洗液不呈碱性为止。将古氏坩埚或g4垂融坩埚放回400ml烧杯中,加25ml fe2(so4)3溶液及25ml水,用玻璃棒搅拌至氧化亚铜完全溶解,以0.02mol/lkmno4标准溶液滴定至微红色为终点。同时吸取50ml水,加入与测样品时相同量的碱性酒石酸甲液、乙液、fe2(so4)3溶液及水,按同一方法做试剂空白试验。

5)结果计算

①根据滴定所消耗kmno4标准溶液的体积,计算相当于样品中还原糖的氧化亚铜的质量,即

m=(v-v0)×c×143.08×5/2=(v-v0)×c×357.7

式中 m——氧化亚铜的质量(mg)

v——测定用样品液所消耗kmno4标准溶液的体积 (ml)

v0——试剂空白试验消耗kmno4标准溶液的体积 (ml)

c——kmno4标准溶液的浓度(mol/l)

143.08——氧化亚铜的摩尔质量(mg/m mol)

②根据上式计算所得氧化亚铜的质量查附录得出相当的还原糖的质量,再按下式计算样品中还原糖的含量,即

w(还原糖)=m1×100/〔(1000×m×v2/v1)〕=m1×v1/(10×m×v2)

式中:w(还原糖)——还原糖的质量分数(%)

m——样品的质量 (g)

m1——查表得出的相当还原糖的质量 (mg)

v1——样品处理液的总体积(ml)

v2——测定用样品处理溶液的体积 (ml)

6)说明

①必须注意反应条件的控制,加入碱性酒石酸铜甲、乙液后必须控制在4min内沸腾,维持沸腾2min,时间要准确,否则会引起较大误差,重现性不好。

②煮沸过程中若发现溶液蓝色消失,说明糖度过高,需减少样品处理液的用量,重新操作,而不应增加碱性酒石酸铜溶液的用量。

③抽滤过程中应防止氧化亚铜沉淀暴露于空气中,需使沉淀始终在液面下避免氧化。

④样品处理中利用cuso4在碱性条件下作为澄清剂,除去蛋白质等成分。



二、糕点、糖果中总糖的测定



测定总糖通常以还原糖的测定方法为基础,将食品中的非还原性双糖,经酸水解成还原性单糖,再按还原糖的测定法测定,测出以转化糖计的总糖量。

若需要单纯测定食品中的蔗糖量,可分别测定样品水解前的还原糖量及水解后的还原糖量,两者之差再乘以校正系数0.95即为蔗糖量,即1g转化糖量相当于0.95g蔗糖量。

在食品加工生产过程中,也常用相对密度法、折光法等简易的物理方法测定总糖量。

1、原理

样品除去蛋白质后,加入稀hcl,在加热条件下使蔗糖水解转化为还原糖,再以直接滴定法或高锰酸钾法测定。

2、仪器

1)恒温水浴箱

2)其他仪器同还原糖的测定

3、试剂

1)6mol/lhcl溶液

2)甲基红指示剂:称取0.1g甲基红溶于100ml60%(体积分数)乙醇中

3)200g/lnaoh溶液

4)转化糖标准溶液:准确称取1.0526g纯蔗糖用100ml水溶解,置于具塞三角瓶中加5mlhcl(1:1),在68~70℃水浴中加热15min。冷却至室温后定容至1000ml。此溶液每ml标准溶液相当于1.0mg转化糖。

5)其他试剂同还原糖的测定

4、测定方法

1)样品处理:按还原糖测定法中的方法进行。

2)样品中总糖量的测定:吸取50ml样品处理液置于100ml容量瓶中,加6mol/lhcl溶液5ml,在68~70℃水浴中加热15min,冷却后加2滴甲基红指示剂,用200g/lnaoh溶液中和至中性,加水至刻度线,混匀,按还原糖测定法中直接滴定法或高锰酸钾法进行测定。

5、结果计算

样品中总糖质量分数的计算公式为

w(总糖)=m1×100/〔(1000×m×(50/v1)×(v2/100)〕=m1×v1/(5×m×v2)

式中:w(总糖)——总糖的质量分数(%)

m——样品的质量 (g)

m1——直接滴定法中10ml碱性酒石酸铜相当于转化糖的质量 (mg)

或高锰酸钾法中查表得出相当的转化糖质量(mg)

v1——样品处理液的总体积(ml)

v2——测定总糖量取用水解液的体积 (ml)

6、说明

1)分析结果的准确性及重现性取决于水解的条件,要求样品在水解过程中,只有蔗糖被水解而其他化合物不被水解。

2)在用直接滴定法测定蔗糖时,为减少误差,碱性酒石酸铜溶液的标定需采用蔗糖标准液,按测定条件水解后进行标定。

3)碱性酒石酸铜溶液的标定

①称取105℃烘干至恒重的纯蔗糖1.0000g,以蒸馏水溶解,移入500ml容量瓶中,稀释至刻度,摇匀。此标准液1ml相当于纯蔗糖2mg。

②吸取蔗糖标准液50ml置于100ml容量瓶中,加6mol/lhcl溶液5ml,在68~70℃水浴中加热15min,冷却后加2滴甲基红指示剂,用200g/lnaoh溶液中和至中性,加水至刻度线,混匀,此标准液1ml相当于蔗糖1mg。

③取经水解的蔗糖标准液,按直接滴定法标定碱性酒石酸铜溶液,则10ml碱性酒石酸铜溶液相当于转化糖的质量为

m2=v×m1/0.95

式中:m1——1ml蔗糖标准水解液相当于蔗糖的质量(mg)

m2——10ml碱性酒石酸铜液相当于转化糖的质量(mg)

v——标定中消耗蔗糖标准水解液的体积(ml)

0.95——蔗糖换算为转化糖的系数

4)利用酶的专一性也可进行酶法水解,如采用β-果糖苷酶(转化糖)进行水解,这种方法的应用,关键在于酶制剂本身的纯度及活力,目前较少采用。



三、糕点、糖果中蔗糖的测定



蔗糖是非还原性双糖,不能用测定还原糖的方法直接进行测定,但蔗糖经酸水解后可生成具有还原性的葡萄糖和果糖,再按测定还原糖的方法进行测定。对于纯度较高的蔗糖溶液,可用相对密度、折光率、旋光率等物理检验法进行测定。

1、原理

样品除去蛋白质等杂质后,用稀hcl进行水解,使蔗糖转化为还原糖。然后按还原糖测定的方法,分别测定水解前后样液中还原糖的含量,两者的差值即为由蔗糖水解产生的还原糖的量,再乘以换算系数0.95即为蔗糖的含量。

2、试剂

1)6mol/lhcl溶液。

2)甲基红指示剂:称取0.1g甲基红溶于100ml60%(体积分数)乙醇中。

3)200g/lnaoh溶液。

4)其他试剂同“糕点、糖果中还原糖的测定”。

3、测定方法

取一定量的样品,按还原糖测定中的方法进行处理。吸取经处理后的样品2份各50ml,分别放入100ml容量瓶中,其中一份加入5ml6mol/lhcl溶液,置于68~70℃水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,加2滴甲基红指示剂,用200g/lnaoh溶液中和至中性,加水至刻度线,混匀。而另一份直接用水稀释至100ml。按直接滴定法或高锰酸钾滴定法测定还原糖。

4、结果计算

蔗糖质量分数的计算公式为

w(蔗糖)=(m2-m1)×0.95×100/〔(1000×m×(50/v1)×(v2/100)〕=(m2-m1)×0.19×v1/(m×v2)

式中:w(蔗糖)——蔗糖的质量分数(%)

m——样品的质量 (g)

m1——未经水解的样液中还原糖的质量 (mg)

m2——经水解后样液中还原糖的质量(mg)

v1——样品处理液的总体积(ml)

v2——测定还原糖取用样品处理液的体积 (ml)

0.95——还原糖还原成蔗糖的系数

    5、说明及注意事项

1)蔗糖在本法规定的水解条件下,可以完全水解,必须严格控制水解条件,以确保结果的准确性和重现性。此外果糖在酸性溶液中易分解,故水解结束后应立即取出并迅速冷却中和。

2)用还原糖法测定蔗糖时,为减少误差,测得的还原糖应以转化糖表示,故用直接法滴定时,碱性酒石酸铜溶液的标定需采用蔗糖标准溶液按测定条件水解后进行标定,标定步骤为:

①称取105℃烘干至恒重的纯蔗糖1.000g,用蒸馏水溶解,并定容至500ml,混匀。此标准溶液1ml相当于纯蔗糖2mg。

②吸取上述蔗糖标准溶液50ml于100ml容量瓶中,加5ml6mol/lhcl溶液,置于68~70℃水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,加2滴甲基红指示剂,用200g/lnaoh溶液中和至中性,加水至刻度,混匀,此标准液1ml相当于纯蔗糖1mg。

③取经水解的蔗糖标准溶液,按直接滴定法标定碱性酒石酸铜溶液。转化糖质量的计算公式为

m2=v×m1/0.95

式中:m1——1ml蔗糖标准水解液相当于蔗糖的质量(mg)

m2——10ml碱性酒石酸铜液相当于转化糖的质量(mg)

v——标定中消耗蔗糖标准水解液的体积(ml)

0.95——蔗糖换算为转化糖的系数

3)若选用高锰酸钾滴定法时,查附录时应查转化糖项。



四、乳及乳制品中乳糖及蔗糖的测定



1、原理

样品经除去蛋白质后,在加热条件下,以亚甲蓝为指示剂,用样液直接滴定费林氏液,达到终点时,稍微过量的还原糖即可将蓝色的亚甲蓝指示剂还原成无色,根据样液消耗量查乳糖及转化糖因素表求得乳糖及蔗糖(用酸水解为转化糖)的含量。

2、试剂

1)亚铁氰化钾溶液:称取10.6g亚铁氰化钾,加水溶解并稀释至100ml。

2)乙酸锌溶液:称取乙酸锌结晶21.9g,加3ml冰醋酸,加水溶解并稀释至100ml。

3)费林氏液(甲液及乙液)。

①甲液:称取34.639g硫酸铜(cuso4·5h2o),加适量水溶解,加0.5ml浓h2so4再加水稀释至500ml,用精制石棉过滤。

②乙液:称取173g酒石酸钾钠及50gnaoh,加适量水溶解,并稀释至500ml,用精制石棉过滤,贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

4)亚甲蓝(次甲基蓝)指示剂。

5)6mol/lhcl溶液。

6)200g/lnaoh溶液。

7)20g/l甲基红-乙醇溶液:称取0.2g甲基红溶于100ml20%(体积分数)乙醇溶液中。

3、操作方法

1)样品处理:准确称取3g左右的样品于小烧杯中,用100ml水分数次溶解并洗入250ml容量瓶,慢慢加入醋酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5ml,轻轻摇动容量瓶。加水至刻度,静置数分钟后以干燥滤纸过滤,滤液备用。

2)乳糖的测定和计算

①测定

a、样品溶液预测定:吸取费林甲液、乙液各5ml,置于150ml锥形瓶中,加水10ml,加入玻璃珠2粒,控制在2min内沸腾,趁热以先快后慢的速度滴加样品溶液,待颜色变浅时,加入亚甲蓝指示剂2~3滴,趁沸以0.5滴/s的速度继续滴定至蓝色刚好褪去为止。纪录消耗样液的体积。

b、样品溶液的测定:吸取费林甲液、乙液各5ml,置于150ml锥形瓶中,加水10ml,加入玻璃珠2粒,从滴定管加入比粗滴定约少0.5~1ml的样品溶液,加热使之在2min内沸腾,并维持沸腾2min。加入亚甲蓝指示剂2~3滴,趁沸以0.5滴/s的速度继续滴定至蓝色刚好褪去为止。纪录消耗样液的体积。

②结果计算

每100ml样液中乳糖的质量(mg)为:

m1=100×m2/ v

式中:

m2——滴定量相对应的乳糖质量(mg)(具体见下表)

v——滴定体积(ml)

若蔗糖含量与乳糖含量之比超过3:1时,则应在滴定量中加上下表后面的校正值后再进行计算(一般甜炼乳需校正)。


样品中乳糖的质量分数为:

w(乳糖)=m1×2.5×100/(1000×m)=m1/(4×m)

式中:w(乳糖)——乳糖的质量分数(%)

m——样品的质量 (g)

m1——乳糖的质量 (mg)

2.5——换算系数,即250/100

3)蔗糖的测定和计算

①转化前转化糖的计算:利用测定乳糖时的滴定量,从前表中查出相对应的转化糖因子,即可计算出转化前100ml样液中转化糖的质量:

m1=100×m2/ v

转化前转化糖的质量分数为

w(转化前转化糖)=m1×2.5×100/(1000×m)=m1/(4×m)

式中:w(转化前转化糖)——转化前转化糖的质量分数(%)

m——样品的质量 (g)

m1——转化前100ml样液中转化糖的质量 (mg)

m2——滴定量相对应的转化糖的质量 (mg)(见上表)

v——测定乳糖时的滴定体积(ml)

②样品溶液的转化和滴定:吸取糖提取液50ml,置于100ml容量瓶中,加5ml6mol/lhcl溶液,置于68~70℃水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,加2滴甲基红指示剂,用200g/lnaoh溶液中和至微酸性,加水至刻度,混匀。

滴定方法与乳糖测定相同。由滴定体积可计算出转化后每100ml样液中转化糖的质量,即

m1=100×m2/ v

转化后转化糖的质量分数为

w(转化后转化糖)=m1×5×100/(1000×m)=m1/(2×m)

③蔗糖质量分数的计算公式为

w(蔗糖)=〔w(转化后转化糖)-w(转化前转化糖)〕×0.95

4)说明及注意事项

①测定乳及乳制品中乳糖及蔗糖的含量也可采用糕点、糖果中测定还原糖及蔗糖的方法。

②费林氏甲、乙液要分别配制、分别储存,临用时按等量混合,以免在碱性溶液中cu(oh)2被酒石酸钾钠缓慢地还原,从而析出少量cuo,使有效浓度降低。

③本法中费林氏液需用乳糖及蔗糖(分析纯)校正。