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菌落总数检测及新手棘手问题

菌落总数所使用标准

 

食品企业一般会用到的两个做菌落总数的标准。(当然还有其他标准)

 

食品国家标准:

gb 4789.2-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

生产用水:

gb-t5750.12-2006 《生活饮用水标准检验方法微生物指标》

 

以这两个标准来说,它们的检测方法是差不多,主要区别在于培养基的不同和样品的状态不同(食品中有固态和液态,生活饮用水只有液态)。食品的培养基是使用pca,生产用水的使用na。

 

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培养基成分

 

pca(平板计数琼脂培养基)

胰蛋白胨      5.0g

酵母浸膏      2.5g

葡萄糖         1.0g

琼脂           15.0g

蒸馏水        1000ml

注:胰蛋白胨提供碳源和氮源;酵母浸粉提供b族维生素;葡萄糖提供能源;琼脂是培养基的凝固剂。

 

na(营养琼脂)

蛋白胨        10g

牛肉膏        3g

氯化钠        5g

琼脂          14g(标准10g-20g)

蒸馏水        1000ml

注:蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源;氯化钠能维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂。

 

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检测方法

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操作注意细节

 

1 菌落总数是比较常规的微生物检测项目,也是比较容易做的一个微生物检测方法,主要注意无菌操作,与稀释液均匀性。

 

2 在空白出现菌落的时候需要去分析哪一步出现问题,人机料法环。当然空白出现菌落的时候,那么该批次的菌落总数数据都作废处理。在制样和做样的时候需要在百级的环境(百级的洁净工作台)下进行。

 

3 稀释液的均匀性,这个会影响结果,刚开始的时候可能会造成同一梯度的两个结果相差有点远,这个是因为做的时候没有把稀释液均匀。如果前后两个梯度没有梯度性,那么就是在做稀释做不好。这个都是靠多做,技术才会提高。(当然还有一种情况,样品是中添加了抑菌物质,这样没有梯度性。)

 

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计数

 

1  可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits , cfu )表示。

 

2  选取菌落数在 30cfu~300cfu 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30cfu的平板记录具体菌落数,大于 300cfu 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

 

3  其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。(这个是很多新手会问的一个问题)

 

4  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。

 

计数(标准中介绍)

1  若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每 g ( ml )样品中菌落总数结果。

 

2  若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式( 1 )计算:

3  若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300cfu,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

 

4  若所有稀释度的平板菌落数均小于 30cfu,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

 

5  若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。

 

6  若所有稀释度的平板菌落数均不在 30cfu~300cfu 之间,其中一部分小于 30cfu 或大于300cfu 时,则以最接近 30cfu 或 300cfu 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

 

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菌落总数的问题(是一些新手问的问题)

 

1.有新人可能会拿着菌落总数的平板去问别人这是什么菌?

答:这是看不出来的,菌落总数只能检测出样品卫生情况,一个样品的细菌数量,不能验证出什么菌。这是一个不应该犯的误区。

 

2.若所有稀释度的平板菌落数均不在 30cfu~300cfu 之间,其中一部分小于 30cfu 或大于300cfu 时。就会有人不知道怎么去判定那个梯度更接近30-300。

举例:一个梯度:28/28;另梯度:305/305,那么那个数据更接近呢?

两个方法(网友提供):

a、按标准字面意思直接做差比较后再乘以稀释倍数:28-30=-2,他们相差2;305-300=5,他们相差5。2比5要小,那么采取28相应的梯度再乘以稀释倍数;

b、恢复为同稀释度做差比较:把两个梯度换算成同一个梯度,一般把28换算成280。280-300=-20,相差20;305-300=5,相差5。20比5要大,那么采取305相应的梯度。

(个人意见:我是更偏向于第二种,因为要在同一个梯度上做比较才能体现出数据的可靠性,同时我偏向采用前一个梯度的数字,那么这个数值可以减少一步步骤带来的误差,数据可能更加接近样品的情况)

 

3.有时候会出现这么一个情况,最低稀释梯度中一个平板出现1个菌落,另一个无菌落生长。那么结果怎么出呢?

答:(以固态为例子)在过去也有讨论过,有人认为报告写5,也有认为报告写<10(比较两个平板均无菌落生长的时候报<10)这个两个报告方法其实也是可以采用。(我是采用第一种;个人理解不长报告<10,那么长了也报<10吗?不太合理)

 

4.在做菌落总数的时候,有时候会样品和菌落分不清的(老前辈不会这样),那么如何区分两种物质呢?

答:在培养基中添加ttc(一般2%浓度1ml加到400ml的培养基中,ttc的浓度不要过高,会有抑制作用)。ttc的原理:ttc和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞。那么生长的菌落会变成红色,这样就可以区分菌落与样品。

还有一个方法:4℃冷藏保存一个样品和培养基混匀的平板做对照,观察菌落的形态特征,老前辈们基本靠这个去区分的。

 

5、菌落总数计数包括霉菌吗?

答:菌落总数的概念是这么规定的,食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度、培养时间等)培养后,所得每g(ml)检样中形成的微生物菌落总数。所以也包括在pca上生长的霉菌和酵母等微生物。

 

6、培养基温度不好控制?

答:前提是培养基灭菌好了放在水浴锅内保温46摄氏度。使用时一个同事在外面把培养基从水浴锅拿到传递窗,培养基表面喷酒精杀菌,然后开启传递窗的紫外灯5min(这一步是对培养基表面杀菌,减少对洁净房的污染)。里面的同事5min之后拿起来放在手心人体不觉烫手,这样的温度最佳倒平板。(注意:倒平板的速度要快,一次最好只拿一瓶,避免培养基凝固)

 

7、有些朋友不理解菌落总数的单位cfu的意思。

答:cfu为colony-forming units英文缩写,其含义是形成菌落的菌落个数,不等于细菌个数。(比如两个相同的细菌靠得很近或贴在一起,那么经过培养这两个细菌将会形成一个菌落,此时就是2个细菌,1cfu)。菌落总数往往采用的是平板计数法,经过培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数,从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落,于是以cfu/ml或cfu/g报告之。

 

8、菌落超标的危害。

答:食品的菌落总数严重超标,说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求,将会破坏食品的营养成分,加速食品的腐败变质,使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品,很容易患痢疾等肠道疾病,可能引起呕吐、腹泻等症状,危害人体健康安全。

但需要强调的是,菌落总数和致病菌有本质区别,菌落总数包括致病菌和有益菌,对人体有损害的主要是其中的致病菌,这些病菌会破坏肠道里正常的菌落环境,一部分可能在肠道被杀灭,一部分会留在身体里引起腹泻、损伤肝脏等身体器官,而有益菌包括酸奶中常被提起的乳酸菌等。但菌落总数超标也意味着致病菌超标的机会增大,增加危害人体健康的几率。

 

9、培养后的培养基出现干裂情况。

答:干裂是由于培养基里面的水份缺失导致,所以当出现干裂情况,先要观察干裂平板的数量和位置。看是否是培养箱内部温度不稳定导致(一般平皿一叠可以放置六个,同时要注意每叠之间需要保留一点间隙让其通风);排除仪器的原因之后,看是培养基否倒得太薄(初学者可以拿三角瓶装水进行练习);还有其他原因,其实在出现干裂的情况下,结果是无效的(除非干裂情况不严重)。排查出问题所在,可以避免我们下次再犯错。

 

10、培养基的配置。

答:培养基的包装上(标准上)都会写着先煮热溶解再分装,那么是不是一定要煮热溶解呢?首先瓶子上的配置方法是直接配置一升的pca,这里是必须要煮热溶解(防止不均匀,使得部分培养基不凝固)。

其实配置培养基有两个方法:第一个:用一个大容器配置培养基,然后加水煮热溶解(注意搅拌,防止烧焦),待溶解完成之后进行分装(这里需要注意安全),再去灭菌。第二个方法就是使用500ml三角瓶(其他容器也可以)配置300ml的培养基,加水稍微溶解(此步不需要加热),再拿去灭菌。