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植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定

1 范围

本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光pcr方法。

本方法适用于核桃露(乳)、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。

2 原理

提取试样中基因组dna,以dna为模板,利用物种特异性引物及探针进行实时荧光pcr扩增检测,同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的ct值,判定试样中是否含有该源性成分。

3试剂和材料

除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合gb 6682的要求。所有试剂均用无

dna酶污染的容器分装。

3.1核桃源性成分jugr2基因检测用引物对序列为:

核桃5’端引物:5’-cgcgcagagaaagcagag-3’

核桃3’端引物:5’-gactcatgtctcgacctaatgct-3’

核桃探针:5’-fam-ttgtgcctctgttgctcctcttccc-tamra-3’

3.2花生源性成分ara b2基因检测用引物(对)序列为:

花生5’端引物:5’-gcaacaggagcaacagttcaag-3’

花生3’端引物:5’-cgctgtggtgccctaagg-3’

花生探针:5’-fam-agctcaggaacttgcctcaacagtgcg-eclipse-3’

3.3 杏仁源性成分prudul基因检测用引物(对)序列为:

杏仁5’端引物:5’-tttggttgaaggagatgctc-3’

杏仁3’端引物:5’-tagttgctggtgctctttatg-3’

杏仁探针:5’-fam-tccatcagcagatgccaccaac- eclipse-3’

3.4芝麻源性成分2s albumim mrna基因检测用引物(对)序列为:

芝麻5’端引物:5’-ccagagggctagggaccttc-3’

芝麻3’端引物:5’-ctcggaattggcattgctg-3’

芝麻探针:5’-fam-tcgcaggtgcaacatgcgacc- tamra-3’

3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物(对)序列为:

榛子5’端引物:5’-ccccgctgtttgtgatat-3’

榛子3’端引物:5’-atgataataagcgatactgtgat-3’

榛子探针:5’-fam-tcccgttctcgtccctgcggt- eclipse-3’

3.6大豆源性成分lectin基因检测用引物(对)序列为:

大豆5’端引物:5’-gccctctactccaccccca-3’

大豆3’端引物:5’-gcccatctgcaagccttttt-3’

大豆探针:5’-fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac- tamra-3’

3.7真核生物18srrna内参照检测用引物(对)序列为:

内参照5’端引物: 5’-tctgccctatcaactttcgatggta-3’

内参照3’端引物: 5’-aatttgcgcgcctgctgccttcctt-3’

内参照探针:5’-fam-ccgtttctcaggctccctctccggaatcgaac- tamra-3’

3.8 ctab缓冲液:55 mmol/l ctab,1400mmol/l nacl,20 mmol/l edta,100 mmol/l tris,

用10%盐酸调节ph 至8.0,121℃高压灭菌20 min, 备用。

3.9 蛋白酶k:20mg/ml。

3.10苯酚:氯仿:异戊醇(体积比:25:24:1)。

3.11 异丙醇。

3.12 70%乙醇。

3.13 taq dna聚合酶。

3.14 dntp混合液。

3.15 te缓冲液(tris-hcl、edta缓冲液):10mmol/l tris-hcl(ph8.0),1 mmol/l edta(ph8.0)。

3.16 10×pcr缓冲液:200 mmol/l kcl,15 mmol/l mgcl2,200 mmol/l tris-hcl(ph8.8)。

4仪器和设备

4.1 组织研磨器。

4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

4.3 恒温水浴锅。

4.4 离心机:离心力12,000g。

4.5 微量移液器(0.5μl~10μl,10μl~100μl,10μl~200μl,100μl~1000μl)。

4.6 实时荧光pcr仪。

4.7 涡旋振荡器。

4.8 天平:感量0.01g。

5分析步骤

5.1 试样总dna的提取

固体样品:将样品粉碎后称取0.3~0.6 g,按下列方法提取dna。也可用等效商品化dna提取试剂盒提取dna。

液体样品:取1 ml 样品于eppordorf管中,加入1 倍体积的异丙醇,混合均匀,室温下沉淀5 min,室温下以12,500 rpm 离心5 min,弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取dna。可按下列方法提取dna,也可用等效商品化dna提取试剂盒提取dna。

(1)将处理后的样品加入2 ml离心管中,加入600 μl ctab缓冲液和40 μl蛋白酶k溶液,振荡混匀,65℃孵育1 h(过夜孵育更好), 期间每隔10 min振荡混匀;

(2)加入500 μl的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),振荡抽提10 min,室温下以12,500 rpm 离心10 min;

(3)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500 rpm 离心10 min;

(4)弃去上清液,用65℃预热的te缓冲液溶解dna;

(5)小心吸取上清,加入200 μl氯仿:异戊醇(24:1),振荡抽提,室温下以12500 rpm 离心15 min;

(6)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500rpm 离心10 min;

(7)弃去上清液,沉淀用70% 乙醇洗涤,离心1min,晾干,溶于50μlte 缓冲液中。

5.2 dna浓度和纯度的测定

取1μl dna溶液,使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量,od260/280值应在1.7~1.9之间时,适宜于pcr扩增。

5.3 实时荧光pcr扩增

反应体系总体积为25μl,其中10×pcr缓冲液5μl,正反向引物(10μmol/l)各1μl,探针(10μmol/l)1μl,dntps(10μmol/l)2μl ,taq dna聚合酶(2.5u)0.2 μl,dna模板(10-100ng/μl)2μl,用灭菌去离子水补足至总体积25μl。真核生物内参照的反应体系同上,仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。

反应参数:50℃ 2min; 95℃ 15min; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 40个循环。

5.4 实验对照

检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的dna为阳性对照,以已知不含该植物源的物种dna为阴性对照,以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。

6结果判断与表述

6.1 质量控制

以下条件有一条不满足时,结果视为无效:

(a)空白对照:无fam荧光信号检出;

(b)阴性对照:无fam荧光信号检出;

(c)阳性对照:有fam荧光信号检出,且fam通道出现典型的扩增曲线,ct值≤35.0;

(d)内参对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的ct值<30.0。

6.2 结果判定

(a)如ct值≤35.0,则判定为被检样品阳性;

(b)如ct值≥40.0,则判定为被检样品阴性;

(c)如35.0<ct值<40.0,则重复试验一次。如再次扩增后ct值仍为35.0<ct值<40.0,则判定被检样品可疑。

6.3 结果表述

结果为阳性者,结合产品标识,表述为“检出xx源性成分”。

结果为阴性者,结合产品标识,表述为“未检出xx源性成分”。

结果为可疑者,结合产品标识,表述为“xx源性成分可疑”。

7防污染措施

检测过程中放置交叉污染的措施按照gb/t 27403中的规定执行。





本方法负责起草单位:河北省食品检验研究院。

验证单位:中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。