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测定食品中蛋白质含量方法

1) 原理

1976年由bradford建立的考马斯亮蓝法,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一。

考马斯亮蓝g-20染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合。

在595nm下测定的吸光度a595,与蛋白质浓度成正比。

特点

(1)灵敏度高

其最低检测蛋白质含量可达1mg,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数,因而光吸收要比folin –酚试剂法大得多。

(2) 测定快速,简洁

只需要加一种试剂.完成一个样品的测定,只要5分钟左右 。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。

(3) 干扰物质少。

缺点

(1) 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差 。

(2) 仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有去污剂等。

(3) 标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

操作方法

1 标准曲线的绘制

① 吸标样:吸取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml牛血清白蛋白标准使用液,分别置于10m1作好标记的试管中。

② 加蒸馏水:吸取1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0.0ml蒸馏水分别加入加有0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml牛血清白蛋白标准使用液的试管中。

③ 加显色剂:于标准管中分别加入5.0m1考马斯亮蓝 g- 250 试剂。

④ 混溶比色:加水至刻度,混匀,静置2min,于波长595nm处测吸光度。

⑤ 绘制标准曲线以牛血清白蛋白含量(ug)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。

样品中蛋白质含量的测定

另取 1 支试管,准确量取 1.00ml 样品提取液,再加入5ml 考马斯亮蓝 g- 250 试剂,充分混合,放置 2min 后,以标准曲线 1 号试管做参比,在 595 nm 波长下比色,记录吸光度。