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培养基质量控制与保存

 一、物理性状的质量控制
应包括20℃ -25 ℃时的ph,并应观察以下内容:加入培养基的量和(或)琼脂层的厚度、颜色、透明度、是否存在肉眼可见的杂质、凝胶稳定性/黏稠度(一致性)、湿度。

灭菌前后都应测定ph,采用连接可渗透陶器型液体接头的电极测定液体培养基的ph,固体培养基可用平头电极或者连接微型探头的电极测定ph,测量时尽量使培养基温度降到20℃-25 ℃,校正通常用接近40 g/l的氢氧化钠或者1 mol/l的盐酸。

二、微生物的质量控制

1.污染检测
在每批制备好的培养基中应当选取部分样品进行污染测试。

2.质控菌株
质控菌种应具有稳定特性,能代表其种并能有效地证明实验室特定培养基的最佳性能。测试菌种应可溯源至国家或国际公认的菌种收藏中心,也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌种,但必须对照标准菌株进行鉴定。实验室应检测和记录储存菌株(stock culture)的相关特性,新复苏的菌种可能会有非特异性反应。最好使用从食品中分离的菌种。


培养基的质控菌种应具备以下性能:具典型反应的强阳性菌种;弱生长的阳性菌种(选择更敏感的菌种);无生化反应的菌种;完全抑制菌种。


3.质控方法
国际食品微生物委员会和培养基菌种卫生工作组(wpcm)介绍了培养基评估用测试菌种的有效收集方法。


(1)即用培养基和试剂

商品化即用培养基的生产厂家如果经过is0 9001和iso 9002体系认证或满足相应质量要求,应向使用方提供资质证明。这时,使用者就不必对培养基进行大量的测试工作,但必须保证其储存条件。


(2)采用商品化合成脱水培养基制备的培养基

按iso/ts 11133-1: 2009 《食品和动物饲料的微生物学 培养基制备和生产指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则》的要求,除了对每批制备好的培养基用标准菌株进行测试外,还应用实际样品进行检测,以更好地保证培养基的质量。对于不含指示剂或选择剂的培养基,只需用阳性测试菌种进行测试。对于含有指示剂或选择剂的培养基,必须使用能证明其指示或选择作用的菌种进行试验。对于复合培养基,即需要加入添加成分的培养基,要用具备上述性能的菌种逐批进行检验。对实验室制备的需加入添加成分的制成培养基同样适用。


(3)按照培养基配方制备的培养基

建议除了按照上述方法进行培养基品质测试外,还要用改良的miles-misra技术、螺旋平板技术或菌落总数技术进行测试,以监控基础材料的质量、培养基性能和实验室内部的配制规范。实际上,食品中包含有应激反应的微生物,还应考虑到培养基在应激细菌恢复方面的适用性。


三、培养基性能测试方法

实验室可采用半定量和定量技术对固体、液体培养基的性能进行测试,在多数情况下能满足对培养基性能测试的要求。

对于特殊情况,如评价一种新的培养基或一个新的生产商的产品等,应采用定量测试法。

1.固体培养基
应用于固体培养基质控程序的技术大都依靠菌落计数。主要应用的技术有:倾注法、涂布法、旋转涂布法、改良的miles-misra方法、半定量划线法和定性划线法。这些方法作为食品实验室的日常方法得到了国际公认。由于倾注法、涂布法及螺旋涂布法在日常工作中经常使用,这里不再介绍,着重介绍一下改良的miles -misra方法、半定量划线法和定性划线法。

(1)改良的miles-misra方法
改良的miles-misra方法是通过测试培养基的生长率(productivity ratio, pr)来检查培养基的性能,通常与对照培养基相比。对照培养基应当是富含营养物质的培养基,如:胰酪胨大豆琼脂。


该方法步骤如下:
①将试验菌株的过夜培养物用缓冲蛋白胨水10倍梯度稀释。
②将试验和对照培养基做成4 mm厚的平板,并使平板表面干燥。
③从最高稀释度(如10-5)开始,分别滴1滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域。
④每个稀释度各取4滴分别加入4个试验和对照培养基,每1滴的涂布超过四分之一平板,并用涂布器从高稀释度开始涂布, 37 ℃培养18h。
⑤对数量和菌落形态进行评价。


评价方法,即按下列方式计算:


pr=ns/no


式中:
pr--生长率;
ns-试验培养基的菌落数;
no-对照培养基的菌落数。
示例:在10-3稀释度,试验培养基上为20个菌落,对照培养基上为25个菌落,则pr=0.80。


(2)半定量划线法
使用本方法时,所有测试培养基应干燥到相同程度,且整个步骤应标注化,以便于比较同批次培养基的测试结果。
用1 ul接种环划线平板。在a区用接种环按0.5 cm的间隔划4条平行线,按同样的方法:b区和c区划线,最后在d区内划一条线。按标准方法所规定的培养时间和温度进行培养。
通常情况下用同一接种环对a区~d区进行划线,在不同区域划线时不需对接种环灭菌。但为了得到低生长指数g1, ,在a区和b区接种应更换接种环或对其进行灭菌。

评价方法:培养后,评估菌落的形状、大小和密度,并计算生长指数g1。每条有菌落生长的划线记作1分,每个培养皿上最多为16分。如果仅一半的线有菌落生长,记作0.5分。如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线一半,则记作0分。记录每个平板的得分总和便得到g1。例如:菌落在a区和b区全部生长,而在c区有一半线生长,则g1为10。


目标菌的生长指数g1大于6时,则判定培养基可接受。非选择性培养基的g1值通常更高。目标菌应呈现典型的生长,而非目标菌的生长应部分或完全被抑制。


(3)定性划线法


该方法只是定性测试,划线培养后,按照要求进行打分,得分是指示性的,可用作固体培养基性能测试的补充。


取1ul测试菌株培养物在测试培养基表面划平行直线,可同时在一个平板上接种多个菌株,但划线不能交叉,然后按标准方法中的培养时间和温度进行培养。


评价方法:培养后按以下方法进行平板生长评估: 0表示无生长, 1表示生长, 2表示良好生长。目标菌得分应为2,并且有典型的菌落外观、大小和形态。非目标菌的生长应该部分或全部被抑制。


2.液体培养基
为确定液体培养基的生长率,应接种适当的培养物。下面介绍的是用定量、半定量和定性方法评估生长率和选择性的方法。所推荐的这些方法都是通过将液体培养基以倾注或划线方式接种到琼脂平板上培养后,计数或计算液体培养基分数而得出其生长数量的。对于液体培养基定性测试方法,则通过肉眼观察来实现。


目标菌和非目标菌的定量稀释法步骤如下:


选择液体培养基10 ml/管待检。


接种目标菌:将少量测试菌株培养物(每管10 cfu~100 cfu)接种测试肉汤和标准肉汤,混匀。


接种非目标菌:将大量测试菌株培养物(每管大于1000 cfu)接种测试肉汤和标准肉汤,混匀。


接种目标菌和非目标菌的混合培养物:用少量目标菌(每管10 cfu ~100 cfu)测试肉汤和标准肉汤。同时每管接种大量非目标菌(每管大于1000 cfu),混匀。


稀释剂和运输培养基中目标菌和非目标菌的接种:接种测试菌于稀释剂中(每管100 cfu~ 1000 cfu),混匀。


按标准方法中的培养时间和温度进行培养。


结果的计算和解释:

(1)计算目标和非目标微生物的菌落数,用生长率(pr)和选择因子(sf)进行结果的解释。
目标微生物的pr不应小于0.1 (因生长的不同不能超过1个数值),非目标微生物的sf至少应达到2。


sf的计算见式 :

sf=do-ds


式中:

do-在参考培养基上能生长至少10个菌落的最高稀释度;

ds-在测试培养基上显示相应生长的最高稀释度;

sf、do和ds用ig表示。

例如:do=lg104=4.0, ds=lg103=3.0,选择因子sf=1.0。

混合菌株中, 目标菌的生长不应受到非目标菌的抑制,即目标菌始终应为优势菌群。


(2)在混合菌株中目标菌数量的最低值及非目标菌数量的最高值应符合以下要求:目标菌的最低浓度应达到10cfu/ml ~10cfu/ml;在选择性肉汤培养物中非目标菌的最高浓度不应超过104 cfu/ml.

(3)稀释和运输培养基不应引起目标菌和非目标菌数量的减少或增加。菌株在这些培养基中培养后的数量变化应在最初计数的±50%的范围内。