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食品中大肠菌群的检测方法

1 范围

本标准规定了食品中大肠菌群(coliforms)计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

2 术语和定义

2.1 大肠菌群coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.2 最可能数most probable number,mpn 基于泊松分布的一种间接计数方法。

3 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

3.1  恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。

3.2  冰箱:2 ℃~5 ℃。

3.3  恒温水浴箱:46 ℃±1  ℃。

3.4  天平:感量 0.1 g。

3.5  均质器。

3.6  振荡器。

3.7  无菌吸管:1 ml(具 0.01 ml 刻度)、10 ml(具 0.1 ml 刻度)或微量移液器及吸头。

3.8  无菌锥形瓶:容量 500 ml。

3.9  无菌培养皿:直径 90 mm。

3.10  ph计或 ph比色管或精密 ph试纸。

3.11  菌落计数器。

4 培养基和试剂

4.1  月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lauryl sulfate tryptose,lst)肉汤

4.2  煌绿乳糖胆盐(brilliant green lactose bile,bglb)肉汤

4.3  结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar,vrba)

4.4  磷酸盐缓冲液

4.5  无菌生理盐水

4.6  无菌 1 mol/l naoh

4.7  无菌 1 mol/l hcl

  大肠菌群mpn计数法

5 检验程序

大肠菌群mpn计数的检验程序见图1。

大肠菌群mpn计数的检验程序

6 操作步骤

6.1 样品的稀释

6.1.1  固体和半固体样品: 称取 25 g 样品,放入盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。

6.1.2  液体样品:以无菌吸管吸取 25 ml 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。

6.1.3  样品匀液的 ph值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/l naoh或 1 mol/l hcl 调节。

6.1.4  用 1 ml 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 ml,沿管壁缓缓注入 9 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支1 ml 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。

6.1.5  根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次,换用1支 1 ml 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15 min。

6.2 初发酵试验

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lst)肉汤,每管接种1ml(如接种量超过1 ml,则用双料lst肉汤),36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

大肠杆菌在月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)上典型特征
大肠杆菌在月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(lst)上典型特征

6.3 复发酵试验

用接种环从产气的lst肉汤管中分别取培养物1环, 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤 (bglb) 管中, 36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

6.4 大肠菌群最可能数(mpn)的报告

按6.3确证的大肠菌群lst阳性管数,检索mpn表(见附录b),报告每g(ml)样品中大肠菌群的mpn值。
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