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农产品真菌类有害生物的检验方法

在植物病害中,大多数是真菌性病害,而且对生产的危害颇为严重。危险性检疫真菌一旦入侵,很难根除或消灭。因此,检验检疫对保护农业生产安全,甚至保障人们生命和生活基本条件,是必不可少的有效措施。

一、小麦矮腥黑穗菌

1 分类地位

小麦矮腥黑穗菌属担子菌亚门、冬孢菌纲、黑粉菌目、黑粉菌科、腥黑粉菌属、麦矮化腥黑穗菌种。

2 主要危害

小麦矮腥黑穗菌主要危害小麦,也侵染大麦、黑麦、冰草等禾本科约 15 个属植物 (包括小麦属、大麦属、燕麦属、黑麦属、山羊草属、冰草属、野麦属、绒草属、毒麦属、雀麦草属、鸭茅属、早熟禾属、三毛草属、剪股颖属、看麦娘属)。小麦矮腥黑穗病是麦类黑穗病中危害最大、最难防治的一种病害,病菌冬孢子在土壤中长期存活 (6~7 年,甚至 10 年),随土壤传播,一旦传入,难以根除。小麦感染后,一般减产 20%~50% ,某些感病品种可减产 50% 以上,甚至达 90% 。同时,还会影响小麦面粉质量,含孢子过多的面粉有鱼腥味 (含三甲胺)而不宜食用。 1972 年,美国西部7 个州发病面积达 241 万公顷,平均减产 17% ,损失小麦 12 亿多千克。该病系花器侵染的局部性病害,病穗不是所有籽粒都受感染,病粒也不是整个都受破坏。侵染从种脐开始延至腹沟,在表皮下形成黑粉,可侵染到胚乳,但不破坏胚,发病种子仍然萌发。病轻麦粒仅部分受侵染,但形成明显的黑斑。

3 检验方法

(1 )主要仪器设备   筛子、显微镜、离心机、培养皿等。

(2 )形态学检验   冬孢子呈球形或近似球形,黄褐色或褐色,大小为 10~15 μ m ,孢子外壁有刺状突起,网脊尖而长,网目大小为 3~6μ m ,高 1.5~3 μ m ,胶质鞘厚度为 1.5~5.5 μ m ,具有腥味。

(3 )症状和洗涤检查

① 取样及病征检查   样品过筛后,仔细检查有无黑粉病粒及其碎片,可疑者镜检。

② 洗涤检查   步骤如下。

样品加无菌水,振荡 5min 以上,离心 1000r / min , 5~10min ;沉淀加入几滴席尔液;制片镜检 (每一样品至少 5 片);孢子测量:根据孢子大小、网目高度、网脊高度、网鞘厚度进行判断。如 70% 以上的孢子网脊在 1.5~2.5μ m ,胶质鞘厚度 2~3 μ m ,可鉴定为矮腥黑穗菌,而网腥黑穗菌的上述两参数都小于 1.2μ m 。

(4 )冬孢子显微电泳法   矮腥冬孢子囊由多糖蛋白质和脂类等物质构成,其上带有正电荷,它与网腥冬孢子囊不同。在显微镜下观测,它们在电场中的移动速度也不一致,由此可加以区分。见表 51 。

(5 )冬孢子网脊自发荧光率法   利用矮腥冬孢子网脊自发荧光率高于其他黑粉菌的特性,结合形态特征进行鉴定。

(6 )孢子萌发检验   冬孢子在 3% 水洋菜培养基 ( wa 培养基)上,置于 5℃ 光照培养。一周左右萌发者为网腥冬孢子, 20 天到 3 个月开始萌发者为矮腥冬孢子。网腥冬孢子和矮腥冬孢子的萌芽特征如下。

① 网腥冬孢子:先菌丝较少,有分支,担孢子 (小孢子)一般为 4~16 个;

② 矮腥冬孢子:先菌丝有分支,担孢子数量多,可达 50~60 个。

(7 )其他鉴别新方法   主要包括:冬孢子水解作用;凝集反应;高碘酸消解细胞壁;冬孢子胶鞘负染;冬孢子变形试验,以此来鉴别矮腥黑穗菌和网腥黑穗菌。上述方法中,高碘酸消解细胞壁和冬孢子胶鞘负染法较为简单方便,但由于各地的冬孢子有所不同,有时易与孢子混淆,故最有效、正确的鉴别方法是利用孢子萌芽,其缺点是需时间较长。

二、玉米霜霉菌

1 分类地位

玉米霜霉菌属鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目、霜霉科。

2 危害性

玉米霜霉病是一种毁灭性病害,一旦发生很难控制。引起玉米霜霉病的病原菌包括霜指霉菌、指疫霉菌和指梗霉菌三类九种。近年该病在东南亚地区,特别是印度、印度尼西亚、菲律宾、泰国、巴基斯坦等邻邦国家已经流行,在我国也有发生。

3 检验方法

(1 )仪器设备   显微镜。

(2 )症状检验   该菌所致症状的特点是,病叶淡绿至淡黄色或苍白色,有紫色条纹和条斑,湿度高时在叶背面形成灰白色霉状物,即病菌的无性繁殖体游动孢子囊梗和游动孢子囊。以后条纹和条斑颜色逐渐加深变褐,组织坏死。幼苗染病后生长缓慢,节间缩短,植株矮化。重病株不能正常抽穗。果穗雄花畸形。各种霜霉病症状有时因病原菌种类和环境条件变化而有所不同。指疫霉菌使叶片发生斑驳、叶脉不规则增厚、花序多育、雄穗畸形呈刺猬状等所谓 “疯顶”的特别症状。

(3 )形态学检验   孢囊梗 1 根至数根,丛生,自气孔伸出,主梗 (轴)较粗壮,基部膨大,长宽径 (83~208 )μ m× (96~24 )μ m ,叉状分支 2~6 次,顶枝 (末枝)弯曲,长宽径(64~224 )μ m× (16~32 )μ m ;孢子囊卵圆形或椭圆形,大小为 (192~282 )μ m×(192~24 )μ m ,平均 25 μ m×234 μ m 。

  三、马铃薯癌肿病菌

1 分类地位

马铃薯癌肿病菌属鞭毛菌亚门、壶菌纲、壶菌目、集壶菌科、集壶菌属。

2 危害性

马铃薯癌肿病菌属菌在自然条件下主要危害马铃薯。另外,此菌还能够侵染番茄、甘苦茄、龙葵、豕草属、假酸浆属、酸浆属和蜀羊属。该病主要危害块茎,对马铃薯产量和质量影响很大,发病后结薯块减少,产量降低,产量损失可达 50% 以上,甚至毁产;同时品质变劣,不能食用或种用。病块薯块也不易煮烂,并易引起储藏期烂窖。

3 检验方法

(1 )主要仪器设备   切片刀、显微镜、电子天平、量筒、离心机。

(2 )薯块检验   首先检查块茎上有无癌瘤,特别要注意检查芽眼组织,可将其做徒手切片,镜检有无夏孢子囊和休眠孢子囊,周围细胞是否有菊花瓣状增生。由于病组织往往有不同程度的木质化或木栓化,可加 1 滴 1% “藏花红”染色液以示区别,健康组织细胞壁呈亮红色,感病组织细胞壁呈暗红色。另外,也可将小块组织置于灭菌水玻片上静置 30min ,见有大量游动孢子放出,用 1%锇酸或 01% 升汞 ( hgcl2 )一滴固定游动孢子,在空气中晾干。再用 1% 碱性红或 1%~5% “甲紫液” 1 滴染色 1min ,洗去紫液后镜检,可见单鞭的游动孢子和双鞭毛的接合子。注意有些未表现症状的薯块,也可能带菌,故仅凭肉眼检查是不够可靠的。

(3 )土壤检验   氢氟酸 ( hf )萃取法是一种较好的检查土壤休眠孢子囊的方法,也可以作定量研究。具体步骤如下。

① 收集土样   收集黏附在薯块上的土壤,或采集田间土壤,经自然风干,除去粗大土块和砂粒。

② 用 hf 溶解土样中硅质物和有机质   取土壤3g,放入聚乙烯离心管中 (不能用玻璃管),注入浓 hf (43%~51% )至半管,小心搅拌 5~7 次 ( hf 有毒,操作时要注意安全),使土壤中的硅物质 (sio 2 ,硅酸盐等)溶解,有机质彻底分解。

③ 离心分离   向离心管中加入蒸馏水至管口 15cm 处,再均匀搅拌一次,然后以 2500~3000r / min 离心 10~15min 。倒去上清液,再加蒸馏水至原高度,搅拌后再离心 10min ,如此重复做 4 次土壤洗涤。

④ 镜检   将沉淀底部的湿土用 10~15ml 的蒸馏水分次洗出,这时的洗液可用于镜检。这一方法也可以作定量测定。

(4 )形态学检验   该菌不形成菌丝体,是整体产果式的内生专性寄生菌,菌体可产生原始孢囊堆,并由此形成夏孢囊堆和夏孢子囊,即游动孢子囊,经游动配子的配合形成 “接合子”,进而发育为休眠孢子囊。夏孢子囊大小为 (403~77 )μ m× (314~644 )μ m ,游动孢子或配子为单核、单鞭毛,大小为 20~25μ m 。休眠孢子囊,球形或卵形,黄褐色。具厚壁,分为三层,内壁薄而无色,中壁光滑,黄金褐色,外壁厚,色较暗。具有不规则的脊突,大小不一,直径 25~75μ m 。春季萌发可产生游动孢子和休眠孢子。

四、大豆疫霉菌

1 分类地位

大豆疫霉菌属于鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目、腐霉科、疫霉属大豆转化种。

2 主要危害

大豆疫霉菌的寄主专化性较强,主要侵染大豆。此外,还可以危害羽扁豆属、菜豆、豌豆、双化扁豆、红花、欧芹、甜菜、菠菜、胡萝卜、马铃薯、番茄、甘蔗、紫苜蓿、低地三叶草等。该病可侵染各生长阶段的大豆,造成种腐、苗期死亡、根瘤等症状,具有很大的危险性和毁灭性。在感病品种上,大豆疫病可造成损失 25% ~50% ,个别高感品种损失可达60%~75% 或更多。据报道,在美国依阿华州,有些低洼田块大豆疫病非常严重,以至造成全植株枯死,被害种子蛋白质含量会明显降低。

3 检验方法

(1 )主要仪器设备   培养皿、电子天平、显微镜、筛子。

(2 )种子检疫   检验大豆种子表面附着的病菌,可进行常规的种子洗涤检验,观察是否有疫病的卵孢子 (注意与大豆霜霉卵孢子相区别)。必要时,挑取种子中的病粒,进行分离培养。在基础培养基中可加入各种抗生素和药剂,制成选择性培养基,即在每 1000ml 基础培养基 (常用玉米粉、 v8 汁或胡萝卜、利马豆汁培养基)中,加入多维菌素 10mg 、氨苄西林 250mg 、利福平 10mg 、五氯硝基苯 100mg 、土菌消 (恶霉灵) 5mg 等。该菌的分离比较困难,主要原因是菌丝体在种子表面的存活时间较短。分离疫霉菌时,由于该菌在种子表面的存活时间较短,首先要进行人工接种,培养后测定其活性,以确定确实分离得到了活菌。测定其致病性,再作进一步鉴定。

(3 )土壤中分离病菌

① 过筛法   土壤悬浮液通过不同孔径的筛子过筛,获得疫霉菌卵孢子。

② 诱捕法   在病土中加入无菌水,搅匀后加入 pcnb 、青霉素、利富平,使其浓度达到各 50mg / l ,以抑制杂菌生长。然后将适合的诱饵,如大豆胚芽、白羽扇豆胚根等,放入其中,置适温下诱捕,发病后立即分离病菌。

(4 )病残体的检疫   将根、茎、荚、叶的病残体用乳酪油透明后,镜检卵孢子。

(5 )生物测定   将待测的病土壤、病籽粒或病残体混入灭菌土壤中,播种健康大豆种子,观察发病情况。必要时,可用上述选择性培养基,从病组织中分离病原菌,进一步鉴定。另外,应用 pcr (聚合酶链反应)方法可以对土壤中的卵孢子 dna 直接进行检测,同时应用 dna 测序技术加以验证。

五、烟草霜霉菌

1 分类地位

烟草霜霉菌属鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目、霜霉属。

2 主要危害

烟草霜霉菌可以侵染多种烟草属植物,其中,栽培烟草受害最烈。茄子、番茄、辣椒和马铃薯也能被侵染。烟草霜霉病在苗床和田间都能发生,蔓延速度很快,可引起大量植株枯死。它是烟草的毁灭性病害,严重降低烟草的产量和品质。在病害流行年份,烟草可减产 10%~60% 。1960 年,欧洲大流行后,损失烟草 275×104t ; 1961 年意大利和北非,烟草被害率高达80% 。

3 检验方法

(1 )主要仪器设备   显微镜。

(2 )症状检验   幼嫩叶片发病,病叶直立;较大叶片发病初期形成黄色圆斑,随后病斑中间下陷,背面产生灰色或蓝色霉层,严重时病斑融合成褐色坏死大斑,病叶皱缩扭曲;常表现系统感染,烟株矮化凋萎;在花、蒴果上也出现病斑。

(3 )形态学检验   菌丝无隔,多核管状。无性态产生孢囊梗和孢子囊。孢囊梗树枝状,无色,长 450~750μ m ,其上生有孢子囊。孢子囊卵圆状或柠檬状,无色透明,大小 (17~28 )μ m× (13~17 )μ m 。

六、大丽轮枝菌

1 分类地位

大丽轮枝菌属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、淡色孢科、轮枝孢属。

2 主要危害

大丽轮枝菌属菌的寄主范围很广,目前,已知的寄主植物涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形科、菊科、锦葵科等多达数百种,包括棉花、茄子、马铃薯、烟草、辣椒、番茄、芝麻、南瓜、甜瓜、黄瓜、蚕豆、大豆、绿豆、花生、苘麻、向日葵、甜菜、丁香、糖槭、江西腊、龙葵、酸浆、苍耳、草莓等。棉花黄萎病由大丽轮枝菌所致且危害性很大,虽不使棉花迅速枯死,但病株叶片变黄干枯,结铃减少,落铃率高,严重影响棉花产量和质量。在自然条件下,苗期很少发病,病株高峰出现在棉株生长的中后期,病株的棉铃脱落率,一般比健株明显下降。减产幅度因发病迟早和受害轻重而不同,一般可达 20%~60% 。黄萎病不仅对棉花产量影响大,而且,对棉花纤维的长度和强度也有较大影响。

3 检验方法

(1 )主要仪器设备   量筒、培养皿、培养箱、电子天平。

(2 )形态学检验   大丽轮枝菌的菌落初为白色,在培养基上培养,随后形成大量黑色微菌核,菌落变为黑色。菌丝体初为无色,逐渐变粗而后细胞壁加厚呈黑褐色,许多厚壁细胞集结成褐色微菌核。分生孢子梗轮状分支,梗长 110~130μ m ,分支大小为 (137~214 )μ m× (23~27 )μ m 。分生孢子无色,单胞,长卵圆形,大小为 (23~91 )μ m×(15~30 )μ m 。