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食品中黄曲霉毒素的检测方法

1  范围

本标准规定了牛乳及其制品、奶油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素 m1 与b1 的测定方法。

本标准适用于牛乳及其制品、奶油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素 m1 与b1 的测定。

2  原理

样品经提取、浓缩、薄层分离后,黄曲霉毒素 m1  与b1  在紫外光(波长 365nm)下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。

3  试剂和材料

3.1   甲醇:分析纯。

3.2   石油醚:分析纯。

3.3   三氯甲烷:分析纯。

3.4   无水硫酸钠:分析纯。

3.5   异丙醇:分析纯。

3.6   硅胶 g:层析用。

3.7   氯化钠及氯化钠溶液(40 g/l) 。

3.8   硫酸(1 3) 。

3.9  玻璃砂:用酸处理后洗净干燥,约相当 20目。

3.10   黄曲霉毒素 m1 标准溶液:用三氯甲烷配制成每毫升相当于 10μg 的黄曲霉毒素 m1 标准溶液。以三氯甲烷作空白试剂,黄曲霉毒素 m1 的紫外最大吸收峰的波长应接近 357 nm,摩尔消光系数为 19950。避光,置于 4 ℃冰箱中保存。

3.11  黄曲霉毒素 m1与 b1 混合标准使用液:用三氯甲烷配制成每毫升相当于各含 0.04 μg 黄曲霉毒素m1 与 b1。避光,置于 4℃冰箱中保存。

4  仪器和设备

4.1  10 目圆孔筛。

4.2  小型粉碎机。

4.3  玻璃板:5 cm×20 cm。

4.4  展开槽: 长25 cm,宽 6 cm,高 4 cm。

4.5  紫外光灯:100 w~125 w,带365 nm滤光片。

4.6  微量注射器。

5  分析步骤

整个操作需在暗室条件下进行。

5.1  样品提取

5.1.1  样品提取制备表,见表 1。

食品中黄曲霉毒素的检测方法

5.1.2  乳与炼乳:称取 30.00 g 混匀的样品,置于小烧杯中,再分别用 90 ml 甲醇移于 300ml 具塞锥形瓶中,盖严防漏。振荡 30 min,用折叠式快速滤纸滤于 100 ml 具塞量筒中。按表 1 收集62 ml 乳与52 ml 炼乳(各相当于 16 g 样品)提取液。

5.1.3   乳粉:取 15.00 g样品,置于具塞锥形瓶中,加入 20 ml 水,使样品湿润后再加入 90 ml 甲醇,以下按 5.1.3自“振荡 30 min……”起,依法操作,按表 1 收集 59 ml 提取液(相当于 8 g 样品)

5.1.4   干酪:称取 15.00 g 切细、过10 目圆孔筛混匀样品,置于具塞锥形瓶中,加 5 ml 水和 90 ml甲醇,以下按 5.1.3 自“振荡 30 min……”起依法操作,按表 1 收集56 ml 提取液(相当于 8 g 样品)

5.1.5  奶油:称取 10.00 g 样品,置于小烧杯中,用 40 ml 石油醚将奶油溶解并移于具塞锥形瓶中。加 45 ml 水和 55 ml 甲醇,振荡 30 min 后,将全部液体移于分液漏斗中。再加入 1.5 g 氯化钠摇动溶解,待分层后,按上表收集 80 ml提取液(相当于 8 g 样品)于具塞量筒中。

5.1.6   新鲜猪组织:取新鲜或冷冻保存的猪组织样品(包括肝、肾、血、瘦肉)先切细,混匀后称取30.00 g,置于小乳钵中,加玻璃砂少许磨细,新鲜全血用打碎机打匀,或用玻璃珠振摇抗凝。混匀后称取 30.00 g, 将各样品置于 300 ml 具塞锥形瓶中, 加入 90 ml甲醇, 以下按 5.1.3 自“振荡 30 min……”起依法操作。按上表收集 59 ml 猪肝,61 ml 猪肾,58 ml 猪瘦肉及 61 ml 猪血等提取液(各相当于16 g 样品) 。

5.2  净化

5.2.1   用石油醚分配净化:将以上收集的提取液移入 250 ml 分液漏斗中,再按各种食品加入一定体积的氯化钠溶液(40 g/l) (见表 1) 。再加入 40 ml 石油醚,振摇 2 min,待分层后,将下层甲醇-氯化钠水层移于原量筒中,将上层石油醚溶液从分液漏斗上口倒出,弃去。再将量筒中溶液转移于原分液漏斗中。再重复用石油醚提取两次,每次 30 ml,最后将量筒中溶液仍移于分液漏斗中。奶油样液总共用石油醚提取两次,每次 40 ml。

5.2.2   用三氯甲烷分配提取:于原量筒中加入 20 ml 三氯甲烷,摇匀后,再倒入原分液漏斗中,振摇2 min。待分层后,将下层三氯甲烷移于原量筒中,再重复用三氯甲烷提取两次,每次 10 ml 合并于原量筒中。弃去上层甲醇水溶液。

5.2.3   用水洗三氯甲烷层与浓缩制备:将合并后的三氯甲烷层倒回原分液漏斗中,加入 30 ml 氯化钠溶液(40 g/l) ,振摇30 s,静置。待上层混浊液有部分澄清时,即可将下层三氯甲烷层收集于原量筒中。加入 10 g 无水硫酸钠,振摇放置澄清后,将此液经装有少许无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于 100 ml蒸发皿中。氯化钠水层用 10 ml 三氯甲烷提取一次,并经过滤器一并滤于蒸发皿中。最后将无水硫酸钠也一起倒于滤纸上,用少量三氯甲烷洗量筒与无水硫酸钠,也一并滤于蒸发皿中,于 65 ℃水浴上通风挥干,用三氯甲烷将蒸发皿中残留物转移于浓缩管中,蒸发皿中残渣太多,则经滤纸滤入浓缩管中。于 65 ℃用减压吹气法将此液浓缩至 0.4 ml 以下,再用少量三氯甲烷洗管壁后,浓缩定量至 0.4 ml 备

用。

5.3   测定

5.3.1  硅胶g薄层板的制备

薄层板厚度为 0.3 mm,105 ℃活化 2 h,在干燥器内可保存 1d~2d。

5.3.2  点板

取薄层板(5 cm×20 cm)两块,距板下端 3 cm的基线上各滴加两点,在距第一与第二板的左边缘0.8 cm~1 cm处各滴加 10 μl  黄曲霉毒素 m1 与b1 混合标准使用液,在距各板左边缘 2.8 cm~3 cm处各滴加同一样液点(各种食品的滴加体积见表 1) ,在第二板的第 2 点上再滴加 10 μl 黄曲霉毒素 m1 与b1  混合标准使用液。一般可将薄层板放在盛有干燥硅胶的层析槽内进行滴加,边加边用冷风机冷风吹干。

5.3.3  展开

5.3.3.1  横展:在槽内加入 15 ml 事先用无水硫酸钠脱水的无水乙醚(每 500 ml 无水乙醚中加 20 g无水硫酸钠) 。将薄层板靠近标准点的长边置于槽内,展至板端后,取出挥干,再同上继续展开一次。

5.3.3.2  纵展:将横展两次挥干后的薄层板再用异丙醇-丙酮-苯-正己烷-石油醚(沸程 60 ℃~90 ℃)-三氯甲烷(5 10 10 10 10 55)混合展开剂纵展至前沿距原点距离为 10 cm~12 cm取出挥干。

5.3.3.3  横展:将纵展挥干后的板再用乙醚横展 1 次~2 次,展开方法同 5.3.3.1。

5.3.4  观察与评定结果

5.3.4.1   在紫外光灯下将第一、二板相互比较观察,若第二板的第二点在黄曲霉毒素 m1 与b1 标准点的相应处出现最低检出量(m1 与 b1的比移值依次为 0.25和0.43) ,而在第一板相同位置上未出现荧光点,则样品中黄曲霉毒素 m1 与b1含量在其所定的方法灵敏度以下(见表 1) 。

5.3.4.2  如果第一板的相同位置上出现黄曲霉毒素 m1 与b1 的荧光点,则第二板第二点的样液点是否各与滴加的标准点重叠,如果重叠,再进行以下的定量与确证试验。

5.3.5  稀释定量

样液中的黄曲霉毒素 m1与 b1 荧光点的荧光强度与黄曲霉毒素 m1 与b1的最低检出量(0.0004 μg)的荧光强度一致,则乳、炼乳、乳粉、干酪与奶油样品中黄曲霉毒素 m1 与 b1 的含量依次为 0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、0.5 μg/kg及 0.5 μg/kg;新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉)样品均为 0.2 μg/kg(见表 1) 。如样液中黄曲霉毒素 m1 与 b1 的荧光强度比最低检出量强,则根据其强度逐一进行测定,估计减少滴加微升数或经稀释后再滴加不同微升数, 直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。

5.3.6   确证试验

在做完定性或定量的薄层板上,将要确证的黄曲霉毒素 m1 和 b1 的点用大头针圈出。喷以硫酸溶液(1 3),放置 5 min 后,在紫外光灯下观察,若样液中黄曲霉毒素 m1和 b1 点与标准点一样均变为黄色荧光,则进一步确证检出的荧光点是黄曲霉毒素 m1 和b1。

6  分析结果的表述

黄曲霉毒素 m1 或 b1 的含量按式(2)进行计算。
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