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高效液相色谱仪hplc测定豆类食品中异黄酮含量方法

大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。由于是从植物中提取,与雌激素有相似结构,因此称为植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性,是天然的癌症化学预防剂。异黄酮是一种弱的植物雌激素,大豆是人类获得异黄酮的惟一有效来源。

本文选取我国居民日常食用的主要豆制品,对其中雌激素样活性较强的染料木素和大豆苷元以 及它们对应的糖苷进行定量检测,从大豆异黄酮的组成和含量两方面进行分析评估,进而了解我国豆制品中大豆异黄酮含量的基本情况,为以后全面深入的研究奠定 基础。由于食品中大豆异黄酮的检测尚无国家标准,因此选用较通用的高效液相色谱法为本研究的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品;大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素;正己烷、甲醇(分析纯);甲醇(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

waters 1525高效液相色谱仪,系统包括515hplc双泵、waters 2996光电二级管列检测器;dzg-6050真空干燥箱;kq-2200超声波清洗器。

1.3 方法

1.3.1样品制备

固体样品10~45 g,粉碎,55℃真空干燥24h,进一步粉碎,每份称取0.2 g;加5ml正己烷,超声脱脂10 min,离心(3 000 r/min,3 min)。弃去正己烷;加10ml 80%甲醇,超声萃取10min,离心(3 000 r/min,3 min),转移上清液,通风橱中70℃水浴挥发至干,80%甲醇复溶至0.4ml,过膜,待测。

液体样品10 ml;加2.5 ml正己烷,超声萃取10 min,静置,弃去上层脂肪层。取2 ml溶液。加8 ml甲醇,超声萃取10 min,离心(3 000 r/rain,3 min),转移上清液,通风橱中70℃水浴挥发至干,80%甲醇复溶至0.4 ml,过膜,待测。

1.3.2 hplc条件

色谱柱为kromasil c18柱(4.6minx250mm,5um);流动相为甲醇(a)/水(b),梯度洗脱条件:0-15 min,30%~70%b,15~30 min。70%-30%b;流速0.6 ml/min;柱温25℃;进样量20ul;检测波长254 nm。

1.3.3标准曲线的绘制

称取4种对照品各5 mg左右,然后分别置于10 ml容量瓶中,80%甲醇溶解,定容、摇匀,配成约0.5 mg/ml贮备液。再由贮备液分别配成约2、4、8、16、32、64、128 mg/l的7个浓度梯度工作液,hplc检测。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

由分离结果图1可看出,在此色谱条件下4种化合物分离良好,保留时间合适。

2.1.1线性关系及检出限

高效液相色谱仪hplc测定豆类食品中异黄酮含量方法

由表l回归系数可看出,在2~128 mg/ml浓度范围内。各峰线性关系良好,可用于定量分析。进样量为20ul时,大豆苷(d)、染料木苷(g)、大豆苷元(da)、染料木素(ge)的最 低检出浓度(以s/n≥3计)分别为:0.200、0.015、0.400、0.0060ug/ml。
高效液相色谱仪hplc测定豆类食品中异黄酮含量方法
2.1.2回收率
每类样品选1个样,在测得已知含量的样品溶液中,按方法学原则,在0.5~2倍之间取3个浓度0.5、l、2,加标,测3次,计算回收率。每类样品在不同 加标倍数下,4种化合物的回收率范围分别为d:88.30%-105.53%。g:84.92%-l 13.7%,da:93.07%-115.76%,ge:91.18%-107.92%。rsd范围:1.22%-3.56%。说明此方法加标回收率较 好,准确度较高。

2.1.3精密度

每类样品选1个样,连续进样6次,检测结果发现每类样品中,4种化合物含量的rsd值均≤2.78%,说明此方法重现性好,精密度高。

2.1.4重现性

每类样品选1个样,每个样称取同等质量5份。按上述方法制备后对每份样做含量检测,检测结果发现每类样品中。4种化合物含量的rsd值均≤2.58%,说明此方法重现性好,准确度高。