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食品绿脓杆菌的检验方法

绿脓杆菌在自然界分布甚广,空气、水、土壤中均有存在。它对人体致病,常引起人皮肤化脓感染,特别是烧伤、烫伤、眼部疾病者被感染后,常使病情恶化,并可引起败血症。因此,在化妆品标准中规定不得检出绿脓杆菌。

1.检验原理

其检查方法是根据绿脓杆菌生物学特征:革兰氏阴性杆菌,氧化酶阳性,能产生绿脓菌素。此外,还能液化明胶,还原硝酸盐为亚硝酸盐,在42 ℃下生长等。可与类似菌相区别。

2. 仪器

培养箱、三角烧瓶、试管、灭菌平皿、灭菌刻度吸管、显微镜、载玻片、接种针或接种环、电炉、高压消毒锅。

  3.培养基和试剂

(1)  scdlp液体培养基

制备方法与前述scdlp液体培养基制备一致。

(2)  十六烷基三甲基溴化铵培养基:配方见表8-27所示。

表8-27  十六烷基三甲基溴化铵培养基配方

物质                   用量

物质                   用量

牛肉膏                 3 g

蛋白胨                 10 g

nacl                   5 g

十六烷三甲基溴化铵     0.3 g

琼脂                   20 g

  蒸馏水               1000 ml

制备方法:除琼脂外,将上述物质混合加热溶解,调ph为 7.4~7.6,加入琼脂,在69 kpa压力下灭菌20 min后,制成平板,备用。

(3)乙酰胺培养基:配方见表8-28所示。

表8-28  乙酰胺培养基配方

物质                   用量

物质                   用量

乙酰胺                 10.0 g

k2hpo4                 1.39 g

kh2po4                 0.73 g

琼脂                   20 g

nacl                   15.0 g

酚红                   0.012 g

mgso4·7h2o            0.5 g

蒸馏水                 1000 g

制备方法:除琼脂和酚红外,将其它成分加到蒸馏水中,加热溶解,调ph为7.2,加入琼脂、酚红,在0.1 mpa压力下高压灭菌20 min后,制成平板,备用。

(4)绿脓菌色素测定用培养基:配方见表8-29所示。

表8-29  绿脓菌色素测定用培养基配方

物质                   用量

物质                   用量

蛋白胨                 20 g

mgcl2                  1.4 g

k2so4                  10 g

琼脂                   18 g

甘油(化学纯)         10 g

蒸馏水                 1000 ml

制备方法:将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中,加温使之溶解,调ph至7.4,加入琼脂和甘油,加热溶解,分装于试管内,在69 kpa压力下高压灭菌20 min后,制成斜面,备用。

(5)明胶培养基:配方见表8-30所示。

表8-30  明胶培养基配方

物质                   用量

物质                   用量

牛肉膏                  3 g

 

明胶                    120 g

蛋白胨                 5 g

 

蒸馏水               1000 ml

制备方法:取各成分加在蒸馏水中浸泡20 min,随时搅拌加温使溶解,调ph至7.4,分装于试管内,经在69 kpa压力下灭菌20 min后,直立制成高层,备用。

(6)硝酸盐蛋白胨水培养基:配方见表8-31所示。

表8-31  硝酸盐蛋白胨水培养基配方

物质                   用量

物质                   用量

蛋白胨                 10 g

酵母浸膏               3 g

蒸馏水                 1000 g

亚硝酸钠               0.5 g

硝酸钾                 2 g

制备方法:将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中,加温使溶解,调ph值为7.2。煮沸过滤后补足液量,加入硝酸钾和亚硝酸钠,溶解混匀,分装到加有小倒管的试管中,在69 kpa压力下灭菌20 min后,备用。

(7)普通琼脂斜面培养基:配方见表8-32所示。

表8-32  普通琼脂斜面培养基配方

物质                   用量

物质                   用量

蛋白胨                 10 g

琼脂                   15 g

牛肉膏                 3 g

nacl                   5 g

蒸馏水                 1000 ml

 

制备方法:除琼脂外,其余成分溶解于蒸馏水中,调ph为7.2~7.4,加入琼脂,加热溶解,分装试管,在0.1 mpa压力下高压灭菌15 min后,制成斜面,备用。

    4.检验步骤

(1)增菌培养:取1∶10样品稀释液10 ml加到90 ml scdlp液体培养基中,置42 ℃培养箱中,培养(18~24)h,如有绿脓杆菌生长,培养液面会有一层薄菌膜,培养液呈黄绿色或蓝绿色。如无scdlp液体培养基时,可用普通肉汤培养基。检验含防腐剂的化妆品时,在每1000 ml普通肉汤中加1 g卵磷脂,7 g吐温80。

(2)分离培养:从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上。置37 ℃培养(18~24)h。凡绿脓杆菌在此培养基上,其菌落为扁平无定型,向周边扩散或略有蔓延。表面湿润,菌落呈灰白色。菌落周围培养基常有水溶性色素扩散。此培养基选择性强,大肠艾希氏菌不能生长,革兰氏阳性菌生长较差。也可以用乙酰胺培养基进行分离,将菌液划线接种于平皿中,放37 ℃培养24 h,绿脓杆菌在此培养基上生长良好,菌落扁平,边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其它菌不生长。

(3)染色镜检:挑取可疑的菌落,涂片,革兰氏染色,镜检为革兰氏阳性者进行氧化酶试验。

(4)氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的10 g/l二甲基对苯二胺试液,在(15~30)s内出现粉红色或紫红色,为氧化酶试验阳性;若培养物不变色,氧化酶试验阴性。

(5)绿脓菌素试验:取可疑菌落(2~3)个,分别接种在绿脓菌素测定用培养基上,37 ℃培养24 h,加入氯仿(3~5)ml,充分振荡,使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内,待氯仿提取液呈蓝色时,用吸管将氯仿移到另一试管中,并加入l mol/l的盐酸 l ml左右,振荡后,静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性,表示被检物中有绿脓菌素存在。

(6)硝酸盐还原产气试验:挑取被检的纯培养物,接种在硝酸盐胨水中,于37 ℃培养24 h,观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者,即为阳性,表明该菌能还原硝酸盐,并将亚硝酸分解产生氮气。

(7)明胶液化试验:取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物,穿刺接种在明胶培养基中,于37 ℃培养24 h,取出放入冰箱(10~30)min,如仍是溶解状即为明胶液化试验阳性,如凝固不溶者为阴性。

(8)42 ℃生长试验:提取纯培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,放在(41~42) ℃培养箱中,培养(34~48)h,绿脓杆菌能生长,为阳性。近似的荧光假单胞菌则不能生长。

(9)检验结果报告:被检样品经增菌分离培养后,经证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者,即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌;如绿脓菌素试验阴性而液化明胶,硝酸盐还原产气和42 ℃生长试验三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。