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金黄色葡萄球菌的检测过程方法

1 范围

本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的检验方法。

本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1  恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。

2.2  冰箱:2 ℃~5 ℃。

2.3  恒温水浴箱:37 ℃~65 ℃。

2.4  天平:感量 0.1 g。

2.5  均质器。

2.6  振荡器。

2.7  无菌吸管:1 ml(具 0.01 ml 刻度)、10 ml(具 0.1 ml 刻度)或微量移液器及吸头。

2.8  无菌锥形瓶:容量 100 ml、500 ml。

2.9  无菌培养皿:直径 90 mm。

2.10  注射器:0.5 ml。

2.11  ph计或 ph比色管或精密 ph试纸。

3 培养基和试剂

3.1  10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤

3.2  7.5 %氯化钠肉汤

3.3  血琼脂平板

3.4  baird-parker琼脂平板

3.5  脑心浸出液肉汤(bhi) 

3.6  兔血浆

3.7  稀释液:磷酸盐缓冲液

3.8  营养琼脂小斜面

3.9  革兰氏染色液

3.10  无菌生理盐水

第一法   金黄色葡萄球菌定性检验

4 检验程序

金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。



5 操作步骤

5.1 样品的处理

称取 25 g 样品至盛有 225 ml 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 ml 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。若样品为液态,吸取 25 ml 样品至盛有225 ml 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。

5.2 增菌和分离培养

5.2.1  将上述样品匀液于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长,污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。

5.2.2  将上述培养物, 分别划线接种到 baird-parker平板和血平板, 血平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。baird-parker平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h 或45 h~48 h。

5.2.3  金黄色葡萄球菌在 baird-parker平板上,菌落直径为 2 mm~3 mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度,偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。



金黄色葡萄球菌在bp琼脂上典型特征

5.3 鉴定

5.3.1 染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5 μm~1 μm。

5.3.2 血浆凝固酶试验: 挑取、 baird-parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上, 分别接种到5 ml bhi和营养琼脂小斜面,36 ℃ ±1 ℃培养18 h~24 h。

取新鲜配置兔血浆 0.5 ml,放入小试管中,再加入 bhi培养物 0.2 ml~0.3 ml,振荡摇匀,置 36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察 6 h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。

结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 ml bhi,36 ℃±1 ℃培养 18 h~48 h,重复试验。

5.4 葡萄球菌肠毒素的检验

可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录b检测葡萄球菌肠毒素。

6 结果与报告

6.1 结果判定:符合 5.2.3、5.3,可判定为金黄色葡萄球菌。

6.2 结果报告:在 25 g(ml)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。

金黄色葡萄球菌在海博金黄色葡萄球菌显色培养基上典型特征

金黄色葡萄球在甘露醇高盐琼脂培养基上典型特征