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乳制品相关的菌种检测方法

方法一:基准法—6.5℃,培养10天(仲裁法)(idf标准101a:1991)

1 适用范围:适用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。

2 方法提要

2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。。

2.2 将培养皿在6.5℃条件下培养10天。

2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数,选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。

3试剂

3.1 稀释液

生理盐水:0.85%的氯化钠水溶液,灭菌。

3.2 培养基

平板计数琼脂23.5g 脱脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要时用滤纸过滤。调节ph值为6.9±0.1。将培养基分装倒入三角瓶中,每瓶100—150ml。在121±1℃下灭菌15min,如果培养基马上要用,用水浴锅冷却到46±1℃。如果不是,则为了不耽误培养基的使用,在实验开始前,将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化,然后再放入水浴中冷却到46±1℃。

注:其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。

4 仪器及玻璃器皿

微生物实验室常用仪器,制备和稀释样品所用仪器以及:

4.1 培养箱,可以调节并保持到6.5±0.5℃

4.2 ph计,带温度补偿,精度为0.1

4.3 水浴,可以保持到46±1℃

4.4 三角瓶,250—300ml,带合适的塞子。

4.5 吸管,用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧。

4.6 培养皿,玻璃或塑料的,直径在90—100mm

5.操作步骤

5.1样品的稀释及培养

5.1.1 以无菌操作,将25ml样品注入含有225ml灭菌生理盐水的三角瓶内,充分混匀,制成1:10的稀释液。

5.1.2用1ml灭菌吸管吸取1:10的稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内,充分混匀,制成1:100的稀释液。

5.1.3另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序,作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次,即换用1支吸管。

5.1.4根据对样品污染情况的估计,选择2—3个适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。

注:其他稀释方法可以使用,例如第一步稀释可以是10ml检测样品注入到90ml稀释液中,或11ml检测样品注入到99ml稀释液中。当样品和稀释液用量更大,方法的精密度和准确度就更高。

5.1.5稀释液移入平皿后,应及时将凉至46℃的培养基(可放置于46±1℃水浴保温)注入平皿约15ml,并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入空的灭菌平皿内作空白对照。

注:从稀释样品到倾倒培养基,整个操作过程不应超过15min。

5.1.6待培养基凝固,翻转平板,放入6.5℃培养箱内培养10天。

注:每叠皿不应超过6个,每叠皿之间以及与培养箱的壁之间应保持一定的间隙。

5.2 菌落计数方法

对平皿进行菌落计数时,应在柔和的光线下计数。为了便于计数,可使用适当的放大镜和(或)菌落计数器。以防极小的菌落遗漏,以及避免将平皿中杂质颗粒进行计数。仔细检查可疑的物质,如需要可使用更高倍数的放大镜,以区别菌落和外来物质。

5.3 菌落计数的报告

5.3.1平板菌落数的选择

平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而另一半菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内若有链状菌落生长时(菌落之间无明显界限),若仅有一条链,可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计。

5.3.2稀释度的选择及报告

5.3.2.1 选取菌落数在10-300之间的培养皿作为计数的测定标准。

5.3.2.2 若有两个稀释度,其生长的菌落数在10-300之间,则按下面的方法计数。

计算每ml牛奶中微生物的个数n,用以下的公式:

∑cn =(n1 0.1n2)d

这里∑c: 是所有皿上菌落数的总和。

n1: 是第一个稀释度培养皿的个数。

n2: 是第二个稀释度培养皿的个数。

d: 是与第一个稀释液相对应的稀释因子

结果保留两位有效数字,后面的数字以四舍五入计算。当第三位数是5时,看其左边的数是奇偶数进行数字取舍;如28500进行数字取舍为28000,11500为12000。

结果以科学计数法表示。

举例

微生物计数给出以下的结果(包括两个带盖培养皿):

在第一个稀释度(10e-2):168和215个菌

在第二个稀释度(10e-3):14和25个菌落

∑c              168 215 14 25         422

n =                   =                         =             =19182

(n1 0.1n2)d         [2 (0.1*2)]*10-2            0.022

根据上面所说结果进行取舍为19000,结果为1.9×104个/ml。

注:如果有两个以上可以计数的稀释度,公式应修改为用多个稀释度进行计算。如为三个稀释度,由下面的公式可计算出每毫升中微生物的数量。

∑cn =(n1 0.1n2 0.01n3)d

5.3.2.3 如果菌落数均小于10,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数,报告每毫升牛奶菌落的估计数。

5.3.2.4 如果菌落数均超过300,则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数,报告每毫升牛奶菌落的估计数。

方法二:快速法—21℃,培养25h(idf标准132a)

1 范围

本标准描述的是通过21℃时快速菌落计数技术进行嗜冷菌菌数估算的方法。

此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验—当需要很快的得到嗜冷菌估算值的时候。

2 方法提要

2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。

2.2 将培养皿在21℃条件下培养25h。

2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数,选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。

3 试剂

3.1 稀释液

生理盐水:0.85%的氯化钠水溶液,灭菌。

3.2 培养基

平板计数琼脂23.5g 脱脂奶粉1g,溶于1000ml水中。必要时用滤纸过滤。调节ph值为6.9±0.1。将培养基分装倒入三角瓶中,每瓶100—150ml。在121±1℃下灭菌15min,如果培养基马上要用,用水浴锅冷却到46±1℃。如果不是,则为了不耽误培养基的使用,在实验开始前,将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化,然后再放入水浴中冷却到46±1℃。

注:其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。

4 仪器及玻璃器皿

微生物实验室常用仪器,制备和稀释样品所用仪器以及:

4.1 培养箱,可以调节并保持到21±1℃

4.2 ph计,带温度补偿,精度为0.1

4.3 水浴,可以保持到46±1℃

4.4 三角瓶,250—300ml,带合适的塞子。

4.5 吸管,用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧。

4.6培养皿,玻璃或塑料的,直径在90—100mm

5. 操作步骤

5.1样品的稀释及培养

稀释步骤同方法一中5.1.1—5.1.5。

5.1.6待培养基凝固翻转平板,放入21℃培养箱内培养25h。

注:每叠皿不应超过6个,每叠皿之间以及与培养箱的壁应保持一定的间隙。

5.2菌落计数方法

同方法一中5.2。

5.3 菌落计数的报告

同方法一中5.3。